Posttranskriptionelle Expressionsregulation der Angiotensin-II-(Typ1)-Rezeptor mRNA durch RNA-Bindungsproteine:
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS:
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
DAS
RENLN-ANGLOTENSLN-SYSTETN
1
1.2.
DIE
ANGIOTENSIN
IL-REZEPTOREN
2
1.3.
DER
ANGIOTENSIN
LL-(TYP1)-REZEPTOR
3
1.3.1
STRUKTUR
DES
ANGIOTENSLN-LL-(TYP1)-REZEPTORS
3
1.3.2.
VOM
ANGIOTENSIN
LL-(TYP1)-REZEPTOR
VERMITTELTE
BIOLOGISCHE
WIRKUNGEN
4
1.3.3.
SIGNALTRANSDUKTIONSWEGE
DES
ANGOTENSIN-LL-(TYP1)-REZEPTORS
5
1.3.4.
REGULATION
DES
ANGIOTENSLN-LL-(TYP1)-REZEPTORS
6
1.3.4.1.
HOMOLOGE
REGULATION
7
1.3.4.2.
HETEROLOGE
REGULATION
7
1.4.
POSTTRANSKRIPTIONEILE
REGULATION
DER
ANGLOTENSLN-LL-(TYP1)-REZEPTOR
MRNA
8
1.4.1.
KONTROLLE
DER
GENEXPRESSION
DURCH
MRNA-STABILITAET
8
1.4.2.
DESTABILISIERUNG
DER
AT
1
-REZEPTOR
MRNA
11
1.5.
MOEGLICHE
PATHOPHYSL
OLOGLSCHE
BEDEUTUNG
DER
AT1-REZEPTOR
REGULATION
12
1.6.
ZIELE
DIESER
ARBEIT
13
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
14
2.1.
MATERIAL
14
2.1.1.
VERWENDETE
MATERIALIEN
14
2.1.2.
VERWENDETE
LOESUNGEN
UND
PUFFER
17
2.2.
METHODEN
20
2.2.1.
DNA-KONSTRUKTE
UND
MUTATIONEN
20
2.2.1.1.
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
UND
DNA-PRAEPARATION
20
2.2.2.2.
KONTROLLE
DER
PLASMID-DNA
DURCH
VERDAU
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
21
2.2.2.3.
KONTROLLE
DER
PLASMID-DNA
DURCH
PCR
21
2.2.2.4.
DELETIONSMUTAGENESE
DURCH
EXONUCLEASE
III
VERDAU
22
2.2.2.5.
KLONIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
23
2.2.2.6.
KLONIERUNG
DER
CALRETICULIN
CDNA
23
2.2.2.7.
KLONIERUNG
DER
GN13-DELETIONSMUTANTE
25
2.2.3.
METHODEN
ZUR
DETEKTION
VON
MRNA-BLNDUNGSPROTEINEN
AUS
GLATTEN
GEFAESSMUSKELZELLEN
25
2.2.3.1
PRAEPARATION
UND
KULTIVIERUNG
GLATTER
GEFAESSMUSKELZELLEN
(VSMC)
AUS
RATTENAORTEN
25
2.3.3.2.
ISOLATION
VON
POLYSOMALEN
PROTEINFRAKTIONEN
AUS
GLATTEN
GEFAESSMUSKELZELLEN
(VSMC)
26
2.2.3.3.
HERSTELLUNG
VON
MRNA
DURCH
RADIOAKTIVE
UND
NICHTRADIOAKTIVE
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
27
2.2.3.4.
UV-CROSSLINKASSAYS
29
2.2.4.
EXPERIMENTE
ZUR
DETEKTION
UND
ISOLATION
VON
MRNA
BINDUNGSPROTEINEN
AUS
RATTENNIEREN
30
2.2.4.1
ISOLATION
VON
POLYSOMALEN
PROTEINFRAKTIONEN
AUS
RATTENNIEREN
30
2.2.4.2
STANDARD-IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
31
2.2.4.3.
FPLC-ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
32
2.2.4.4.
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
UND
FAERBUNG
VON
PROTEINEN
32
2.2.5.
EXPERIMENTE
ZUR
FUNKTIONALITAET
VON
MRNA
BINDUNGSPROTEINEN
33
2.2.5.1.
TRANSFEKTION
VON
GLATTEN
GEFAESSMUSKELZELLEN
(VSMC)
DURCH
ELEKTROPORATION
33
2.2.5.2.
ISOLATION
VON
GESAMT-RNA
34
2.2.5.3.
NORTHERN-BLOT
EXPERIMENTE
UND
HERSTELLUNG
RADIOAKTIV
MARKIERTER
CDNA-SONDEN
34
2.2.5.4.
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
CALRETICULIN
35
2.2.5.5.
WESTERN-BLOT
EXPERIMENTE
36
2.2.5.6
IN
V/TRO-DECAY
EXPERIMENTE
37
2.2.5.7.
IN
VITRO
PHOSPHORYLIERUNG
VON
CALRETICULIN
38
2.2.5.8.
RNA-SEKUNDAERSTRUKTUREN
38
3.
ERGEBNISSE
39
3.1.
KARTIERUNG
VON
PROTELNBTNDUNGSSTELLEN
AUF
DER
AT1-REZEPTOR
MRNA
39
3.1.1.
KLONIERUNG
VERSCHIEDENER
DNA-FRAGMENTE
AUS
DER
3'UTR
DES
AT1-REZEPTORS
39
3.1.2.
IDENTIFIKATION
VON
PROTEINBINDUNGSSTELLEN
DURCH
UV-CROSSLINKING
41
3.1.3.
FUNKTIONELLE
ANALYSE
VON
PROTEINBINDUNGSSTELLEN
AUF
DER
AT1
-REZEPTOR
MRNA
47
3.1.4.
COMPUTERMODELLE
ZUR
DARSTELLUNG
VON
AT1
-REZEPTOR
MRNA
SEKUNDAERSTRUKTUREN
IM
BEREICH
VON
PROTEINBINDUNGSSTELLEN
50
3.2.
ISOLATION
UND
CHARAKTERISIERUNG
EINES
AT1-REZEPTOR
MRNA
BINDUNGSPROTEINS
52
3.2.1.
AUFREINIGUNG
EINES
AT1-REZEPTOR
MRNA
BINDUNGSPROTEINS
DURCH
SEQUENZIELLE
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
52
3.2.2.
DARSTELLUNG
VON
CALRETICULIN
ALS
AT1
-REZEPTOR
MRNA
BINDUNGSPROTEIN
54
3.2.3.
DER
EINFLUSS
VON
CALRETICULIN
AUF
DIE
STABILITAET
DER
AT1
-REZEPTOR
MRNA
57
3.2.4.
DER
EINFLUSS
VON
ANGIOTENSIN
II
AUF
DIE
EXPRESSION
UND
PHOSPHORYLIERUNG
VON
CALRETICULIN
58
4.
DISKUSSION
60
4.1.
IDENTIFIKATION
UND
CHARAKTERISIERUNG
EINES
AN
DER
DESTABILISIERUNG
DER
AT1
-REZEPTOR
MRNA
BETEILIGTEN
SEQUENZMOTIVS
61
42.
ISOLATION
UND
CHARAKTSRLSLERUNG
EINES
AT1-ROZEPTOR
MRNA
BINDUNGSPROTEINS
64
4.3.
AUSBLICK
67
5.
ZUSAMMENFASSUNG
68
6.
LITERATURVERZEICHNIS
69
7.
VORABVEROEFFENTLICHUNGEN
80
8.
LEBENSLAUF
81 |
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