Quantitative Expressionsanalyse antimikrobieller Peptide im Gastrointestinaltrakt des Menschen: Einfluss der Candida-albicans-Infektion auf die Expression von a- und b-Defensinen sowie RNase 7 im Ösophagus
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|---|---|
| adam_text | Titel: Quantitative Expressionsanalyse antimikrobieller Peptide im Gastrointestinaltrakt des Menschen
Autor: Meyer, Daniela
Jahr: 2006
I Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Keimbelastung des menschlichen Gastrointestinaltraktes 1
1.2 Abwehrmechanismen 2
1.2.1 Das erworbene Immunsystem 2
1.2.2 Das angeborene Immunsystem 2
1.2.2.1 Humane Defensine 3
1.2.2.2 RNase7 8
1.3 Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes 8
1.3.1 Soorösophagitis 9
1.4 Ziele der Arbeit 10
2 Material und Methoden 11
2.1 Material 11
2.2 Methoden 11
2.2.1 Gewinnung der Gewebeproben 11
2.2.2 RNA-Isolation 13
2.2.3 Quantifizierung der RNA 13
2.2.4 Reverse Transkription 14
2.2.5 Herstellung der Primer 14
2.2.6 Annealing Temperatur 14
2.2.7 Polymerasekettenreaktion (PCR) 15
2.2.8 Gel-Elektrophorese 16
2.2.9 Quantitative real-time Polymerasekettenreaktion (q rt PCR) im
LightCycler® 16
2.2.10 Präparation von Standards für die quantitative real-time PCR 17
2.2.10.1 Amplifikation und Aufreinigung der spezifischen PCR-
Produkte 17
2.2.10.2 Vektor-Klonierung und Transformation 17
2.2.10.3 Anlegen einer Masterplatte und Kolonie-PCR 18
2.2.10.4 Plasmidisolierung und Sequenzierung 18
2.2.10.5 Linearisierung der Plasmide 19
Inhaltsverzeichnis II
2.2.11 Kalkulation der Plasmidkonzentration 19
2.2.12 Erstellen der Standardkurven 19
2.3 Statistische Analysen 20
3 Ergebnisse 21
3.1 Auswertung der Gewebebiopsien mittels Reverse Transkriptase (RT)-PCR . 21
3.2 Auswertung mittels quantitativer real-time PCR 24
3.2.1 Gesunde Gewebeproben 26
3.2.1.1 HD-5 27
3.2.1.2 HD-6 28
3.2.1.3 hBD-1 29
3.2.1.4 hBD-2 30
3.2.1.5 hBD-3 31
3.2.1.6 hBD-4 31
3.2.1.7 RNase7 32
3.2.2 Auswertung der Biopsien von Patienten mit Soorösophagitis 32
4 Diskussion 34
4.1 Der Gastrointestinaltrakt 34
4.1.1 o-Defensine im Gastrointestinaltrakt 34
4.1.2 ß-Defensine im Gastrointestinaltrakt 35
4.1.3 RNase7 im Gastrointestinaltrakt 36
4.2 Der gesunde Ösophagus 37
4.2.1 a-Defensine im Ösophagus 37
4.2.2 ß-Defensine im Ösophagus 37
4.2.3 RNase7 im Ösophagus 39
4.3 Soorösophagitis 39
4.3.1 a-Defensine bei Soorösophagitis 39
4.3.2 ß-Defensine bei Soorösophagitis 40
4.3.3 RNase7 bei Soorösophagitis 41
4.4 Regulation der Expression antimikrobieller Peptide 42
4.5 Diskussion der Methodik 45
III Inhaltsverzeichnis
5 Zusammenfassung 46
6 Anhang 48
6.1 Primersequenzen 48
6.2 Materialien 49
6.2.1 Chemikalien 49
6.2.2 Puffer 50
6.2.3 Gele 51
6.2.4 Kits 51
6.2.5 Enzyme und Oligonukleotide 52
6.2.5.1 Enzyme 52
6.2.5.2 Oligonukleotide 52
6.2.6 Verbrauchsmaterialien 52
6.2.7 Geräte 52
7 Literaturverzeichnis 54
8 Abbildungsverzeichnis und Tabellenverzeichnis 64
9 Danksagung 65
10 Lebenslauf 66
8 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 64
8 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abb. 1.1: Verknüpfungsmuster der et- und ß-Defensine 4
Abb. 3.1: Vergleichender GAPDH-Nachweis mittels RT-PCR (A) und q rt-PCR (B)
21
Abb. 3.2: Interleukin 1 ß- und Interleukin 8-Expression in Ösophagusbiopsien 22
Abb. 3.3: HNP 1-3-Expression in Ösophagusbiopsien 23
Abb. 3.4: Real-time PCR des Standardplasmids hBD-3 in logarithmischer
Verdünnung. Abhängigkeit der Fluoreszenz von der zugegebenen
Menge des Plasmids und den Zyklenzahlen 24
Abb. 3.5: Standardkurve für hBD-3 25
Abb. 3.6: Schmelzkurvenprofil von hBD-3 26
Abb. 3.7: Expression von humanem a-Defensin-5 im Gastrointestinaltrakt 27
Abb. 3.8: Expression von humanem a-Defensin-6 im Gastrointestinaltrakt 28
Abb. 3.9: Expression von humanem ß-Defensin-1 im Gastrointestinaltrakt 29
Abb. 3.10: Expression von humanem ß-Defensin-2 im Gastrointestinaltrakt 30
Abb. 3.11: Expression von humanem ß-Defensin-3 im Gastrointestinaltrakt 31
Abb. 3.12: Expression von RNase7 im Gastrointestinaltrakt 32
Abb. 3.13: Expression der a- und ß-Defensine und RNase7 im gesunden Ösophagus
und bei Soorösophagitis im direkten Vergleich 33
Tab. 2.1: Gesundes Kontrollkollektiv 11
Tab. 2.2: Gewonnene Biopsien 12
Tab. 2.3: Erkranktes Patientenkollektiv 12
Tab 2.4: Zusammensetzung eines Reaktionsansatzes für die RT-PCR 15
Tab. 2.5: Amplifikationsprotokoll für die RT-PCR 15
Tab. 2.6: Zusammensetzung eines PCR-Reaktionsansatzes für den LightCycler* 16
Tab. 2.7: Amplifikationsprotokoll für die LightCycler®-PCR 17
Tab. 3.1: Interleukinnachweis in Biopsien aus gesundem Ösophagus,
Soorösophagitis und Refluxösophagitis 23
Tab. 3.2: Variationskoeffizienten für Verdünnungsreihen der Primer-Standards 25
|
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Titel: Quantitative Expressionsanalyse antimikrobieller Peptide im Gastrointestinaltrakt des Menschen
Autor: Meyer, Daniela
Jahr: 2006
I Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Keimbelastung des menschlichen Gastrointestinaltraktes 1
1.2 Abwehrmechanismen 2
1.2.1 Das erworbene Immunsystem 2
1.2.2 Das angeborene Immunsystem 2
1.2.2.1 Humane Defensine 3
1.2.2.2 RNase7 8
1.3 Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes 8
1.3.1 Soorösophagitis 9
1.4 Ziele der Arbeit 10
2 Material und Methoden 11
2.1 Material 11
2.2 Methoden 11
2.2.1 Gewinnung der Gewebeproben 11
2.2.2 RNA-Isolation 13
2.2.3 Quantifizierung der RNA 13
2.2.4 Reverse Transkription 14
2.2.5 Herstellung der Primer 14
2.2.6 Annealing Temperatur 14
2.2.7 Polymerasekettenreaktion (PCR) 15
2.2.8 Gel-Elektrophorese 16
2.2.9 Quantitative real-time Polymerasekettenreaktion (q rt PCR) im
LightCycler® 16
2.2.10 Präparation von Standards für die quantitative real-time PCR 17
2.2.10.1 Amplifikation und Aufreinigung der spezifischen PCR-
Produkte 17
2.2.10.2 Vektor-Klonierung und Transformation 17
2.2.10.3 Anlegen einer Masterplatte und Kolonie-PCR 18
2.2.10.4 Plasmidisolierung und Sequenzierung 18
2.2.10.5 Linearisierung der Plasmide 19
Inhaltsverzeichnis II
2.2.11 Kalkulation der Plasmidkonzentration 19
2.2.12 Erstellen der Standardkurven 19
2.3 Statistische Analysen 20
3 Ergebnisse 21
3.1 Auswertung der Gewebebiopsien mittels Reverse Transkriptase (RT)-PCR . 21
3.2 Auswertung mittels quantitativer real-time PCR 24
3.2.1 Gesunde Gewebeproben 26
3.2.1.1 HD-5 27
3.2.1.2 HD-6 28
3.2.1.3 hBD-1 29
3.2.1.4 hBD-2 30
3.2.1.5 hBD-3 31
3.2.1.6 hBD-4 31
3.2.1.7 RNase7 32
3.2.2 Auswertung der Biopsien von Patienten mit Soorösophagitis 32
4 Diskussion 34
4.1 Der Gastrointestinaltrakt 34
4.1.1 o-Defensine im Gastrointestinaltrakt 34
4.1.2 ß-Defensine im Gastrointestinaltrakt 35
4.1.3 RNase7 im Gastrointestinaltrakt 36
4.2 Der gesunde Ösophagus 37
4.2.1 a-Defensine im Ösophagus 37
4.2.2 ß-Defensine im Ösophagus 37
4.2.3 RNase7 im Ösophagus 39
4.3 Soorösophagitis 39
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4.3.3 RNase7 bei Soorösophagitis 41
4.4 Regulation der Expression antimikrobieller Peptide 42
4.5 Diskussion der Methodik 45
III Inhaltsverzeichnis
5 Zusammenfassung 46
6 Anhang 48
6.1 Primersequenzen 48
6.2 Materialien 49
6.2.1 Chemikalien 49
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6.2.5.1 Enzyme 52
6.2.5.2 Oligonukleotide 52
6.2.6 Verbrauchsmaterialien 52
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8 Abbildungsverzeichnis und Tabellenverzeichnis 64
9 Danksagung 65
10 Lebenslauf 66
8 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 64
8 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abb. 1.1: Verknüpfungsmuster der et- und ß-Defensine 4
Abb. 3.1: Vergleichender GAPDH-Nachweis mittels RT-PCR (A) und q rt-PCR (B)
21
Abb. 3.2: Interleukin 1 ß- und Interleukin 8-Expression in Ösophagusbiopsien 22
Abb. 3.3: HNP 1-3-Expression in Ösophagusbiopsien 23
Abb. 3.4: Real-time PCR des Standardplasmids hBD-3 in logarithmischer
Verdünnung. Abhängigkeit der Fluoreszenz von der zugegebenen
Menge des Plasmids und den Zyklenzahlen 24
Abb. 3.5: Standardkurve für hBD-3 25
Abb. 3.6: Schmelzkurvenprofil von hBD-3 26
Abb. 3.7: Expression von humanem a-Defensin-5 im Gastrointestinaltrakt 27
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Abb. 3.9: Expression von humanem ß-Defensin-1 im Gastrointestinaltrakt 29
Abb. 3.10: Expression von humanem ß-Defensin-2 im Gastrointestinaltrakt 30
Abb. 3.11: Expression von humanem ß-Defensin-3 im Gastrointestinaltrakt 31
Abb. 3.12: Expression von RNase7 im Gastrointestinaltrakt 32
Abb. 3.13: Expression der a- und ß-Defensine und RNase7 im gesunden Ösophagus
und bei Soorösophagitis im direkten Vergleich 33
Tab. 2.1: Gesundes Kontrollkollektiv 11
Tab. 2.2: Gewonnene Biopsien 12
Tab. 2.3: Erkranktes Patientenkollektiv 12
Tab 2.4: Zusammensetzung eines Reaktionsansatzes für die RT-PCR 15
Tab. 2.5: Amplifikationsprotokoll für die RT-PCR 15
Tab. 2.6: Zusammensetzung eines PCR-Reaktionsansatzes für den LightCycler* 16
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Tab. 3.1: Interleukinnachweis in Biopsien aus gesundem Ösophagus,
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