Analyse der Prozessierungsaktivität einer pflanzlichen Endoribonuklease unter Verwendung von in-vitro-synthetisierten Modell-RNAs:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1996
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3
ANALYSE DER PROZESSIERUNGSAKTIVITAET EINER PFLANZLICHEN ENDORIBONUKLEASE
UNTER VERWENDUNG VON IN VITRO SYNTHETISIERTEN MODELL-RNAS
DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR.
RER. NAT.) DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET III- BIOLOGIE UND
VORKLINISCHE MEDIZIN
DER UNIVERSITAET REGENSBURG
VORGELEGT VON VON MICHAEL FLORIAN METTE AUS ALTOETTING 1996
IMAGE 2
II
INHALTSVERZEICHNIS SEITE
DECKBLATT
INHALTSVERZEICHNIS
VORBEMERKUNGEN
BEGRIFFE
GROESSENANGABEN
SYMBOLE PHYSIKALISCHER GROESSEN
VI
ABKUERZUNGEN
NUKLEOSIDE UND NUKLEOTIDE
WEITERE ABKUERZUNGEN IX
1 . EINLEITUNG
1.1 EINFUEHRUNG
1.2 MOEGLICHE ZELLEIGENE SUBSTRATE DER NUKLEOLAREN ENDO- RIBONUKLEASE 5
2. AUFGABENSTELLUNG 11
3. ERGEBNISSE
3.1 KONSTRUKTION UND PRAEPARATION VON MODELL-RNAS
13
13
3.2 SPALTUNG DES IN VITRO TRANSKRIPTES HA 106 DURCH DIE NUKLEOLARE
ENDORIBONUKLEASE-PRAEPARATION Q47D 44
IMAGE 3
III
3.3 SPALTUNG VON IN VITRO TRANSKRIPT ST 5 ETS HIND III DURCH DIE
NUKLEOLARE ENDORIBONUKLEASE-PRAEPARATION Q47D 46
3.4 SPALTUNG VON IN VITRO TRANSKRIPT ST 5 ETS-18S RRNA HIND III DURCH
DIE NUKLEOLARE ENDORIBONUKLEASE-PRAE- PARATION Q47D 49
3.5 SPALTUNG VON IN VITRO TRANSKRIPT ST 5,8S RRNA-ITS2- 25S RRNA BARN
HI DURCH DIE NUKLEOLARE ENDORIBO- NUKLEASE-PRAEPARATION Q47D 54
3.6 SPALTUNG VON IN VITRO TRANSKRIPT LE 5,8S RRNA-ITS2- 25S RRNA BARN
HI DURCH DIE NUKLEOLARE ENDORIBO- NUKLEASE-PRAEPARATION Q47D 76
3.7 SPALTUNG VON IN VITRO TRANSKRIPTEN AUS DER GRUPPE ST 25S
RRNA-3 ETS DURCH DIE NUKLEOLARE ENDORIBO NUKLEASE-PRAEPARATION Q47D 81
3.8 SPALTUNG VON IN VITRO TRANSKRIPT LE 25S RRNA-3 ETS BAM HI DURCH
DIE NUKLEOLARE ENDORIBONUKLEASE- PRAEPARATION Q47D 102
3.9 UNTERSUCHUNG DER 3 -ENDEN VON IN VIVO PROZES- SIERUNGSINTERMEDIATEN
DER 25S RRNA DER KARTOFFEL 106
4. DISKUSSION 121
4.1 EIGENSCHAFTEN DER NUKLEOLAREN ENDORIBONUKLEASE AUS KARTOFFEL-ZELLEN
121
4.2 INTERPRETATION DER IN VITRO BEOBBACHTETEN RNA- SPALTUNG IM BEZUG AUF
DIE IN VIVO PROZESSIERUNG DER PRAERIBOSOMALEN RNA 124
5. ZUSAMMENFASSUNG 152
6. AUSBLICK 154
IMAGE 4
7. MATERIAL 156
7.1 GERAETE UND SOFTWARE 156
7.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN 158
7.3 KOMMERZIELLE REAGENZIEN 159
7.4 STAMMLOESUNGEN 162
7.5 SYNTHETISCHE OLIGODESOXYNUKLEOTIDE 169
7.6 BIOLOGISCHE MATERIALIEN 170
7.7 NUKLEOLARE ENDORIBONUKLEASE-PRAEPARATION AUS KARTOFFELZELLEN 171
8. METHODEN ^ 111
8.1 NUKLEINSAEUREREINIGUNG, -FAELLUNG UND -QUANTIFIZIERUNG 177
8.2 QUANTIFIZIERUNG VON RADIOAKTIVITAET 181
8.3 NICHT DENATURIERENDE AGAROSEGELELEKTROPHORESE 183
8.4 DENATURIERENDE AGAROSEGELELEKTROPHORESE 187
8.5 STANDARD-DENATURIERENDE POLYACRYLAMIDGELELEKTRO- PHORESE (KURZ: 5%
SD GEL BZW. 10% SD GEL) 188
8.6 HOCHAUFLOESENDE DENATURIERENDE POLYACRYLAMIDGEL- ELEKTROPHORESE 193
8.7 GEL FUER DEN BEREICH N = 5...50 B (KURZ: 20% HD GEL) 196
8.8 GEL FUER DEN BEREICH N = 50...500 B (KURZ: 8% HD GEL) 197
8.9 GEL MIT FORMAMID FUER DEN BEREICH N = 50...500 B (KURZ: 8% HDF GEL)
198
8.10 PRAEPARATIVES GEL FUER DEN BEREICH N = 50...500 B (KURZ: 5% HD GEL)
200
IMAGE 5
8.11 TEMPERATURGRADIENTENGELELEKTROPHORESE (KURZ:
5% N GEL) 202
8.12 PLASMID-PRAEPARATION 207
8.13 RESTRIKTIONSSPALTUNG VON DNA 211
8.14 POLYMERASE CHAIN REAKTION 212
8.15 KLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN 214
8.16 DIDESOXY -SEQUENZIERUNG 218
8.17 IN VITRO TRANSKRIPTION UND RNA-MARKIERUNG 220
8.18 RNA-ENDGRUPPENBESTIMMUNG 229
8.19 RNA-STANDARDS FUER DIE HOCHAUFLOESENDE PAGE 235
8.20 ENZYMATISCHE SPALTUNG VON MODELL-RNAS 237
8.21 RNA-PRAEPARATION AUS KULTIVIERTEN KARTOFFELZELLEN 242
8.22 RNASE PROTECTION ASSAY 245
9. LITERATUR 249
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