Gentechnologische und physiologische Untersuchungen an Phosphoenolpyruvat(PEP)-Carboxylasen: Struktur einer C 3 -PEP-Carboxylase ; Expression von PEP-Carboxylasen in transgenen C 3 -Pflanzen
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|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1.
EINLEITUNG
1
1.1
ZIELE
DER
GENTECHNIK
MIT
PFLANZEN
2
1.2
BEEINFLUSSUNG
PFLANZENPHYSIOLOGISCHER
VORGAENGE
DURCH
GENTECH
NOLOGISCHE
METHODEN
3
1.2.1
MECHANISMEN
DER
CO
2
-FIXIERUNG
3
1.2.2
VERSUCHE
ZUR
REDUKTION
DER
PHOTORESPIRATION
5
1.3
BEDEUTUNG
UND
EIGENSCHAFTEN
VON
PHOSPHOENOLPYRUVATCARBOXYLASEN
8
2.
MATERIAL
11
2.1
CHEMIKALIEN,
VERBRAUCHSMATERIAL
UND
ENZYME
11
2.2
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
11
2.3
PLASMIDE
13
2.4
GENBANK
14
2.5
BAKTERIEN-UND
PHAGENSTAEMME
14
2.6
MEDIEN
15
2.7
PFLANZENMATERIAL
17
2.8
ANTIKOERPER
17
2.9
OLIGOPEPTID
18
3.
METHODEN
19
3.1
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
DNA
19
3.1.1
PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION
19
3.1.2
PRAEZIPITATION
VON
NUKLEINSAEUREN
19
3.1.3
MINIPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
20
3.1.3.1
"BOILING-PREP"-METHODE
NACH
HOLMES
UND
QUIGLEY
20
3.1.3.2
METHODE
NACH
BIRNBOIM
UND
DOLY
21
3.1.4
MAXIPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
22
3.1.5
MINIPRAEPARATION
VON
X.-DNA
23
3.1.6
OLIGONUKLEOTIDAUFREINIGUNG
24
3.1.7
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
24
3.2
DNA-KLONIERUNG
IN
E.COLI
25
3.2.1
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
25
3.2.2
AUFFUELLEN
UEBERSTEHENDER
5'-ENDEN
("FILL-IN
'
'
-REAKTION)
25
3.2.3
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
VEKTOR-DNA
26
3.2.4
LIGATION
27
3.2.5
PRAEPARATION
KOMPETENTER
ZELLEN
27
3.2.6
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
28
3.2.7
"BLAU-WEISS"-SELEKTION
28
3.3
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
29
3.3.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
29
3.3.2
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
30
3.3.2.1
ISOLIERUNG
MITTELS
SEPHAGLASYY
BAND
PREP
KIT
31
3.3.2.2
ISOLIERUNG
MITTELS
SS-AGARASE
31
3.3.2.3
"HUCKEPACK"-METHODE
31
G)
W
W
GJ
W
W
W
W
W
W
CD
CD
CD
GJ
OOOJW
COGOCOGOGOGO
CD
GO
CD
CD
CD
CDCDCDCDCDCDCDCDCDCDCDM
CDCDCDCDCDCDCD
CO
CO
CD
CD
00
C
00
00
00
CO
*4
X
L
*J
K
J
P
^
(
D
(
J
)
M
O
)
G
)
AE
)
OE
)
O)
J1
OE
CJI
OEL
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
CD
K
CN
A
CD
W
OE
CO
KO
-
KJOEOEA&OKOKOKO^
UEO
K
O
-
*
AAAACOCOUEOCOMMKOKOKOKOKO^^^
KO
G
OKO^OOKO^OEUIAG
OKO^KO^
SCREENING
DER
CDNA-BANK
32
MARKIERUNG
DER
HYBRIDISIERUNGSSONDE
32
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
32
NICHT-RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
MIT
DEM
ECL-KIT
33
PLAQUE-HYBRIDISIERUNG
33
HERSTELLUNG
VON
PLATING-CELLS
34
AUSPLATTIEREN
DER
BAKTERIOPHAGEN
UND
BESTIMMUNG
DES
PHAGENTITERS
34
PLAQUE-TRANSFER
AUF
NITROCELLULOSEFILTER
34
HYBRIDISIERUNG
35
PLAQUE-ELUTION
36
AMPLIFIKATION
DES
X-PHAGEN
37
SOUTHERN-HYBRIDISIERUNG
37
SOUTHERN-BLOT
37
HYBRIDISIERUNG
MIT
(CC
32
P)-MARKIERTEN
SONDEN
38
HYBRIDISIERUNG
UND
DETEKTION
MIT
DEM
ECL-KIT
38
IN
VIVO
EXCISION
VON
REKOMBINANTEN
PBLUESCRIPT-KLONEN
39
ANZUCHT
VON
XL1
BLUE
40
AMPLIFIKATION
DES
HELFERPHAGEN
R408
40
IN
VIVO
EXCISIONSREAKTION
40
SEQUENZIERUNG
41
"ERASE-A-BASE"
41
SEQUENZIERREAKTION
NACH
SANGER
43
HERSTELLUNG
DES
SEQUENZIERGELS
UND
GELELEKTROPHORESE
44
BIOCHEMISCHE
METHODEN
ZUR
CHARAKTERISIERUNG
DER
GENEXPRESSION
DES
CDNA-KLONS
46
KOMPLEMENTATIONSTEST
46
PROTEINEXTRAKTION
AUS
BAKTERIENZELLEN
46
ULTRASCHALLAUFSCHLUSS
46
ALCOA-AUFSCHLUSS
47
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
47
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
48
WESTERN-BLOT
UND
PONCEAU-FAERBUNG
50
IMMUNOSTAINING
51
PEPC-AKTIVITAETSTEST
52
HERSTELLUNG
EINES
FLAVERIASPEZIFISCHEN
ANTIKOERPERS
53
KOPPLUNG
DES
OLIGOPEPTIDS
AN
HAEMOCYANIN
54
IMMUNISIERUNG
DES
KANINCHENS
54
ENZYME
LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
(ELISA)
55
PROTEINEXTRAKTION
AUS
BLATTMATERIAL
56
HERSTELLUNG
EINES
ROHEXTRAKTES
56
BEHANDLUNG
MIT
DOWEX
1X2
57
FRAKTIONIERTE
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
58
ENTSALZEN
DES
PROTEINEXTRAKTES
58
FAELLUNG
MIT
TRICHLORESSIGSAEURE
(TCA)
59
PFLANZENKULTUREN
59
ANZUCHTBEDINGUNGEN
59
PFROPFUNG
VON
KARTOFFELPFLANZEN
60
KREUZUNG
VON
KARTOFFELPFLANZEN
61
4.
ERGEBNISSE
62
4.1
SCREENING
EINER
CDNA-BANK
VON
SOLANUM
TUBEROSUM
62
4.1.1
HERSTELLUNG
DER
HYBRIDISIERUNGSSONDE
UND
WAHL
DER
HYBRIDISIERUNGS
BEDINGUNGEN
62
4.1.2
PLAQUE-HYBRIDISIERUNG
63
4.1.3
SOUTHERN-HYBRIDISIERUNG
64
4.1.4
IN
VIVO
EXCISION
REKOMBINANTER
PBLUESCRIPT-KLONE
67
4.1.5
RESTRIKTIONSKARTIERUNG
67
4.2
SEQUENZANALYSE
DER
ISOLIERTEN
CDNA-KLONE
71
4.2.1
SEQUENZIERUNG
VON
RESTRIKTIONSFRAGMENTEN
71
4.2.2
VERKUERZUNG
DES
CDNA-KLONS
DURCH
EXONUKLEASE
III
72
4.2.3
SEQUENZIERUNG
MIT
SEQUENZSPEZIFISCHEN
PRIMERN
73
4.2.4
SEQUENZIERUNGSSTRATEGIE
UND
SEQUENZ
DES
PEPC-GENS
VON
SOLANUM
TUBEROSUM
73
4.3
UNTERSUCHUNG
DER
EXPRESSION
DES
STPPC-CDNA-KLONS
IN
E.COH
78
4.3.1
KLONIERUNG
DER
STPPC-CDNA
IN
DEN
PROKARYOTISCHEN
EXPRESSIONS
VEKTOR
PTRC
99A
78
4.3.1.1
KONSTRUKTION
DES
VEKTORS
PJN5
79
4.3.1.2
KONSTRUKTION
DES
VEKTORS
PJN6
82
4.3.2
KOMPLEMENTATIONSTESTS
IN
E.COH
PCR1
84
4.3.3
ANALYSE
DURCH
WESTERN-BLOT
UND
IMMUNOSTAINING
85
4.3.4
CHARAKTERISIERUNG
DER
ENZYMAKTIVITAET
88
4.3.4.1
BESTIMMUNG
DER
PEPC-AKTIVITAET
88
4.3.4.2
EINFLUSS
VON
INHIBITOREN
UND
AKTIVATOREN
AUF
DIE
PEPC-AKTIVITAET
90
4.3.4.3
BESTIMMUNG
DES
K
M
-WERTES
91
4.4
HERSTELLUNG
EINES
SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPERS
GEGEN
DIE
PEPC
DER
C
4
-PFLANZE
FLAVERIA
TRINERVIA 93
4.4.1
SEQUENZVERGLEICH
UND
AUSWAHL
EINES
GEEIGNETEN
OLIGOPEPTIDS
93
4.4.2
KOPPLUNG
DES
OLIGOPEPTIDS
AN
EINEN
CARRIER
94
4.4.3
UNTERSUCHUNG
DES
ANTISERUMS
DURCH
ELISA
95
4.5
UNTERSUCHUNG
TRANSGENER
KARTOFFELPFLANZEN
96
4.5.1
BESCHREIBUNG
DES
ZUR
VERFUEGUNG
STEHENDEN
PFLANZENMATERIALS
96
4.5.2
WESTERN-BLOT-ANALYSEN
DER
TRANSGENEN
PFLANZEN
97
4.5.2.1
UNTERSUCHUNG
VON
TRANSFORMANTEN
DER
SORTE
Z2
97
4.5.2.2
UNTERSUCHUNG
VON
TRANSFORMANTEN
DER
SORTE
DESIRAEE
99
4.5.3
OPTIMIERUNG
DER
PROTEINEXTRAKTION
101
4.5.4
CHARAKTERISIERUNG
DER
PEPC-AKTIVITAET
IN
DEN
TRANSGENEN
PFLANZEN
105
4.5.4.1
BESTIMMUNG
DER
PEPC-AKTIVITAET 105
4.5.4.2
MESSUNG
DER
K
M
-UND
V
MAX
-WERTE
108
5.
DISKUSSION
113
5.1
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
CDNA-KLONE
113
5.2
EXPRESSION
DER
PEPC-CDNA
IN
E.COH
118
5.3
CHARAKTERISIERUNG
DES
CDNA-CODIERTEN
ENZYMS
121
5.4
UNTERSUCHUNG
TRANSGENER
KARTOFFELPFLANZEN
MITTELS
SPEZIFISCHER
ANTIKOERPER
124
5.5
CHARAKTERISIERUNG
DER
PEPC-AKTIVITAET
IN
DEN
TRANSGENEN
PFLANZEN
129
5.6
AUSBLICK
132
6.
ZUSAMMENFASSUNG
136
7.
ANHANG
138
7.1
VERZEICHNIS
DER
ABKUERZUNGEN
7.2
VERZEICHNIS
DER
ABBILDUNGEN
7.3
VERZEICHNIS
DER
TABELLEN
138
140
142
8.
LITERATURVERZEICHNIS
143 |
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| spelling | Merkelbach, Sabine Verfasser aut Gentechnologische und physiologische Untersuchungen an Phosphoenolpyruvat(PEP)-Carboxylasen Struktur einer C 3 -PEP-Carboxylase ; Expression von PEP-Carboxylasen in transgenen C 3 -Pflanzen vorgelegt von Sabine Merkelbach 1994 155 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 1994 Transgene Pflanzen (DE-588)4311513-5 gnd rswk-swf Kartoffel (DE-588)4029804-8 gnd rswk-swf Phosphoenolpyruvatcarboxylase (DE-588)4291704-9 gnd rswk-swf Genklonierung (DE-588)4123275-6 gnd rswk-swf Genexpression (DE-588)4020136-3 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Kartoffel (DE-588)4029804-8 s Transgene Pflanzen (DE-588)4311513-5 s Phosphoenolpyruvatcarboxylase (DE-588)4291704-9 s Genexpression (DE-588)4020136-3 s DE-604 Genklonierung (DE-588)4123275-6 s DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=006869022&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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