Gamma-Delta-T-Zellen als immuntherapeutisches Konzept beim Neuroblastom:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2006
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Tübingen, Univ., Diss., 2006 (Nur beschränkt für den Austausch) |
| Beschreibung: | VIII, 114 S. graph. Darst. 21 cm |
Internformat
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| adam_text | Titel: Gamma-Delta-T-Zellen als immuntherapeutisches Konzept beim Neuroblastom
Autor: Meier, Sybille Martina
Jahr: 2006
I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS I
ABBILDUNGSVERZEICHNIS IV
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VI
1. EINLEITUNG 1
1.1. Das Neuroblastom 1
1.2. Ontogenese der T-Lymphozyten 3
1.2.1. yST-Zellen 5
1.2.2. aßT-Zellen 7
1.3. Zytokine 8
1.4. Zielsetzung der Arbeit 15
2. MATERIAL UND METHODEN 17
2.1. Material 17
2.1.1. Chemikalien 17
2.1.2. Verbrauchsmaterial 18
2.1.3. Geräte 19
2.1.4. Verwendete Zelllinien und Kulturmedien 20
2.1.4.1. Neuroblastom-Zelllinien 20
2.1.4.2. T-Lymphozyten 20
2.1.5. Kulturmedien 20
2.1.5.1. Kulturmedium für Neuroblastomzellen 20
2.1.5.2. Kulturmedium für y5 T-Lymphozyten 20
2.1.5.3. Einfriermedium 20
2.1.6. Reagenzien für die Molekularbiologie 21
2.1.6.1. RNA-Isolierung 21
2.1.6.2. Reagenzien für die cDNA-Synthese 21
2.1.6.3. Lösungen und Reagenzien für die Poiymerase-Kettenreaktion 21
2.1.6.4. Sense- und Antisenseprimer 22
2.1.7. Antikörper und Reagenzien für die Durchflusszytometrie 23
2.1.7.1. Pufferlösungen 23
2.1.7.2. Antikörper zur Zellseparation (MACS) 23
2.1.7.3. Antikörper zur Durchflusszytometrie (FACS) 24
2.1.8. Antibody Array 24
2.1.9. Lösungen und Reagenzien für die Polyacrylamid-
Gelelektrophorese 25
2.2. Methoden 26
2.2.1. Kultivierung von Neuroblastomzellen 26
2.2.2. Einfrieren und Auftauen von vitalen Zellen 26
2.2.3. Isolierung von y5 T-Lymphozyten 27
2.2.3.1. Lymphozytenseparierung mittels Ficoll-Dichtegradienten-
zentrifugation 27
2.2.3.2. Zellseparation mittels MACS zur Anreicherung definierter Subpo-
pulationen aus PBMNCs (yS-Fraktion, CD4+- oder CD8*-Zellen) 28
2.2.4. Kultivierung von y8 T-Zellen 29
II
2.2.5. Herstellung einer Kokultur aus Neuroblastomzellen
und y8 T-Zellen 30
2.2.6. Molekularbiologische Methoden 30
2.2.6.1. RNA-Isolierung mittels Qiagen-RNeasy Mini-Kit 30
2.2.6.2. cDNA-Synthese (Superscript-Kit) 31
2.2.6.3. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 31
2.2.6.4. Polyacrylamid-Gelelektrophorese 32
2.2.7. Zellanalysen mittels Durchflusszytometrie 34
2.2.7.1. Feststellung des Reinheitsgrades isolierter yS T-Zellen 34
2.2.7.2. Quantifizierung von Oberflächenantigenen 35
2.2.8. Zytokinbestimmung mittels Cytokine Antibody Array 36
3. ERGEBNISSE 37
3.1. Zytokinprofil der Neuroblastomzelllinien auf Transkriptions¬
ebene 37
3.1.1. Vergleich fünf verschiedener Neuroblastomzelllinien anhand ihres
Zytokin- und Markerprofils auf Transkriptionsebene im nativen
Zustand 38
3.1.2. Zytokin- und Markerprofil der Neuroblastomzelllinie LS nativ,
nach Bestrahlung und nach Behandlung mit IFNy 39
3.2. Klassifizierung von T-Zellen anhand der von ihnen sezernierten
Botenstoffe und ihres T-Zellrezeptors 41
3.2.1. Zytokinrepertoire nativer aß T-Zellen im Transkriptom 41
3.2.2 Zytokinrepertoire des Transkriptoms von aß T-Zellen nach
Kokultur mit Neuroblastomzellen 41
3.3. Häufigkeitsverteilung der 5- und y-Ketten im y8 T-Zellrezeptor 43
3.4. Zytokinprofil im Transkriptom nativer y8 T-Zellen, IL-2/PHA-
expandierter und mit Neuroblastomzellen kokultivierter y8 T-Zellen ..44
3.4.1. Zytokinrepertoire nativer y5 T-Zellen 44
3.4.2. Zytokinprofil von y8 T-Zellen nach IL-2/PHA-Expansion 47
3.4.3. Zytokinprofil von y8 T-Zellen nach IL-2/PHA-Expansion und
anschließender Kokultur mit Neuroblastomzellen auf Trans¬
kriptionsebene 51
3.5. Zytokinprofil des Transkriptoms der y8 T-Zellen nach Expansion
mit PAM/IL-2/PHA und nach Kokultur mit Neuroblastomzellen 53
3.5.1. Genexpressionen der y8 T-Zellen nach PAM/IL-2/PHA-Expansion ...53
3.5.2. Zytokinprofil desTranskriptoms von y8 T-Zellen nach Expansion
mit PAM/IL-2/PHA und Kokultur mit Neuroblastomzellen 56
3.6. Genexpressionen des nativen TH1-Typs auf mRNA- und
Protein-Ebene 62
3.7. Gegenüberstellung des Zytokinrepertoires auf Proteinebene
von IL-2/PHA und PAM/IL-2/PHA expandierten y8 s mit und
ohne Neuroblastom-Challenge 65
3.8. Zusammenfassung der Ergebnisse 68
III
4. DISKUSSION 70
4.1. Zytokinprofil nativer y5 T-Zellen 71
4.2. Expression von Apoptose-induzierenden Markern auf
y8 T-Zellen 73
4.3. Expression von GranzymeB/Perforin in y6 T-Zellen 75
4.4. Einfluss von Bisphosphonaten auf das Zytokinprofil der
y5 T-Zellen 75
4.5. Paarung der Ketten des TCR 79
4.6. Regulatorische Potenz der y8 T-Zellen 82
5. ZUSAMMENFASSUNG 90
6. LITERATURVERZEICHNIS 93
6.1. Journals 93
6.2. Bücher 107
7. ANHANG 108
8. DANKSAGUNG 115
9. LEBENSLAUF 116
IV
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 1: Entwicklung der zellulären Komponenten des Immunsystems 4
Abb. 2: Zytokinprofil 5 verschiedener, nativer Neuroblastomzelllinien
im Vergleich 38
Abb. 3: Genexpressionen der Neuroblastomzelllinie LS nativ, nach
Bestrahlung mit 30 und 50 Gy sowie nach Stimulierung mit IFNy 40
Abb. 4: Zytokinprofil CD4+ aß T-Zellen und CD8+ aß T-Zellen
auf Transkriptomebene im Vergleich 41
Abb. 5: Zytokinprofil CD4* aß T-Zellen nativ und nach Kokultur mit
Neuroblastomzellen der Linie LS auf Transkriptomebene 42
Abb. 6: Transkriptom CD8+ aß T-Zellen nativ und nach Kokultur mit
Neuroblastomzellen 43
Abb. 7: Transkriptom der y5 T-Zellen des TH1-Typs (Sp 5), TH2-Typs
(Sp 1+2) und TH1/TH2-Mischtyps (Sp 3,4,6,7,8) im nativen
Zustand 46
Abb. 8: Genexpressionen der y8 T-Zellen des TH1-Typs nativ (n=1)
und nach Expansion mit IL-2/PHA über 14-21 Tage (n=1) 47
Abb. 9: Genexpression der y8 T-Zellen des TH2 (n=2) Typs im Vergleich
nativ und nach Expansion über 14-21 Tage mit IL-2/PHA (n=2) 48
Abb. 10: Vergleich der Genexpressionen der yS T-Zellen des TH1/TH2-
Mischtyps im nativen Zustand (n=5) und nach Expansion mit
IL-2/PHA über 14-21 Tage (n=2) 49
Abb. 11: Genexpressionen der y5 T-Zellen des nativen TH1-Typs (n=1),
TH2-Typs (n=2) sowie des TH1/TH2-Mischtyps (n=2) nach
Expansion mit IL-2/PHA über 14-21 Tage im Vergleich 50
Abb. 12: y8 T-Zellen des nativen TH1-Typs (n=1) nach Expansion mit
IL-2/PHA und Kokultur mit Neuroblastomzellen auf Ebene der
Transkription. Nur dargestellte Zytokine untersucht 51
Abb. 13: y8 T-Zellen des nativen TH2-Typs (n=2) nach Expansion über
14-21 Tage mit IL-2/PHA sowie nach Expansion und Kokultur
mit Neuroblastomzellen auf Transkriptionsebene 52
Abb. 14: Vergleich der Genexpressionen der y5 T-Zellen des nativen
TH1/TH2-Mischtyps nach Expansion mit IL-2/PHA über
14-21 Tage (n=2) sowie nach Expansion und Kokultur mit
Neuroblastomzellen (n=2) auf Transkriptionsebene 53
Abb. 15: Genexpressionen der yS T-Zellen des TH1/TH2-Mischtyps
nativ (n=5) und nach Expansion über 14-21 Tage mit
PAM/IL-2/PHA (n=3) auf Transkriptionsebene 54
Abb. 16: Genexpressionen der y5 T-Zellen des TH1-Typs nativ (n=1)
und nach Expansion mit PAM/IL-2/PHA (n=1) auf Trans¬
kriptionsebene 55
Abb. 17: Genexpressionen der y8 T-Zellen des nativen TH1-Typs (n=1)
nach Expansion mit PAM/IL-2/PHA und nach Expansion
und Kokultur mit Neuroblastomzellen auf Transkriptomebene 57
V
Abb. 18: Transkriptom der y5 T-Zellen des nativen TH1/TH2-Mischtyps
nach Expansion über 14-21 Tage mit PAM/IL-2/PHA (n=3) und
nach Expansion und Kokulturmit Neuroblastomzellen (n=3) 58
Abb. 19: Transkriptom von y8 T-Zellen des nativen TH1-Typs, nach
Expansion mit PAM/IL-2/PHA, sowie nach IL-2/PHA-Expansion 59
Abb. 20: Transkriptom von nativ TH1-Typ-y8 T-Zellen nach Expansion
mit IL-2/PHA, PAM/IL-2/PHA sowie nach Kokultur mit Neuro¬
blastomzellen 59
Abb. 21: Zytokinrepertoire der yS T-Zellen des TH1-Typs nach Expansion
mit IL-2/PHA auf Protein- und Transkriptionsebene im Vergleich 63
Abb. 22: Zytokinrepertoire der y5 T-Zellen des TH1-Typs auf Trans¬
kriptions- und Proteinebene nach Expansion mit IL-2/PHA und
Kokultur mit Neuroblastomzellen der Linie LS im Vergleich 63
Abb. 23: Zytokinrepertoire der y8 T-Zellen des TH-1-Typs nach Expansion
mit PAM/IL-2/PHA auf Protein- und Transkriptionsebene im
Vergleich 64
Abb. 24: Zytokinrepertoire der yS T-Zellen des TH1-Typs auf Transkriptions¬
und Proteinebene nach Expansion mit PAM/IL-2/PHA und Kokultur
mit Neuroblastomzellen im Vergleich 65
Abb. 25: Proteinrelease der y8 T-Zellen des nativen TH1-Typs nach
Expansion mit IL-2/PHA und PAM/IL-2/PHA 66
Abb. 26: Proteinrelease der y5 T-Zellen des nativen TH1-Typs
nach Expansion mit IL-2/PHA bzw. PAM/IL-2/PHA und
anschließender Kokultur mit Neuroblastomzellen der Linie LS 67
Abb. 27: Proteinrelease der y8 T-Zellen des nativen TH1-Typs
nach Expansion mit IL-2/PHA bzw. PAM/IL-2/PHA sowie
Expansion nach beiden Modi und anschließender Kokultur
mit Neuroblastomzellen 67
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Titel: Gamma-Delta-T-Zellen als immuntherapeutisches Konzept beim Neuroblastom
Autor: Meier, Sybille Martina
Jahr: 2006
I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS I
ABBILDUNGSVERZEICHNIS IV
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VI
1. EINLEITUNG 1
1.1. Das Neuroblastom 1
1.2. Ontogenese der T-Lymphozyten 3
1.2.1. yST-Zellen 5
1.2.2. aßT-Zellen 7
1.3. Zytokine 8
1.4. Zielsetzung der Arbeit 15
2. MATERIAL UND METHODEN 17
2.1. Material 17
2.1.1. Chemikalien 17
2.1.2. Verbrauchsmaterial 18
2.1.3. Geräte 19
2.1.4. Verwendete Zelllinien und Kulturmedien 20
2.1.4.1. Neuroblastom-Zelllinien 20
2.1.4.2. T-Lymphozyten 20
2.1.5. Kulturmedien 20
2.1.5.1. Kulturmedium für Neuroblastomzellen 20
2.1.5.2. Kulturmedium für y5 T-Lymphozyten 20
2.1.5.3. Einfriermedium 20
2.1.6. Reagenzien für die Molekularbiologie 21
2.1.6.1. RNA-Isolierung 21
2.1.6.2. Reagenzien für die cDNA-Synthese 21
2.1.6.3. Lösungen und Reagenzien für die Poiymerase-Kettenreaktion 21
2.1.6.4. Sense- und Antisenseprimer 22
2.1.7. Antikörper und Reagenzien für die Durchflusszytometrie 23
2.1.7.1. Pufferlösungen 23
2.1.7.2. Antikörper zur Zellseparation (MACS) 23
2.1.7.3. Antikörper zur Durchflusszytometrie (FACS) 24
2.1.8. Antibody Array 24
2.1.9. Lösungen und Reagenzien für die Polyacrylamid-
Gelelektrophorese 25
2.2. Methoden 26
2.2.1. Kultivierung von Neuroblastomzellen 26
2.2.2. Einfrieren und Auftauen von vitalen Zellen 26
2.2.3. Isolierung von y5 T-Lymphozyten 27
2.2.3.1. Lymphozytenseparierung mittels Ficoll-Dichtegradienten-
zentrifugation 27
2.2.3.2. Zellseparation mittels MACS zur Anreicherung definierter Subpo-
pulationen aus PBMNCs (yS-Fraktion, CD4+- oder CD8*-Zellen) 28
2.2.4. Kultivierung von y8 T-Zellen 29
II
2.2.5. Herstellung einer Kokultur aus Neuroblastomzellen
und y8 T-Zellen 30
2.2.6. Molekularbiologische Methoden 30
2.2.6.1. RNA-Isolierung mittels Qiagen-RNeasy Mini-Kit 30
2.2.6.2. cDNA-Synthese (Superscript-Kit) 31
2.2.6.3. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 31
2.2.6.4. Polyacrylamid-Gelelektrophorese 32
2.2.7. Zellanalysen mittels Durchflusszytometrie 34
2.2.7.1. Feststellung des Reinheitsgrades isolierter yS T-Zellen 34
2.2.7.2. Quantifizierung von Oberflächenantigenen 35
2.2.8. Zytokinbestimmung mittels Cytokine Antibody Array 36
3. ERGEBNISSE 37
3.1. Zytokinprofil der Neuroblastomzelllinien auf Transkriptions¬
ebene 37
3.1.1. Vergleich fünf verschiedener Neuroblastomzelllinien anhand ihres
Zytokin- und Markerprofils auf Transkriptionsebene im nativen
Zustand 38
3.1.2. Zytokin- und Markerprofil der Neuroblastomzelllinie LS nativ,
nach Bestrahlung und nach Behandlung mit IFNy 39
3.2. Klassifizierung von T-Zellen anhand der von ihnen sezernierten
Botenstoffe und ihres T-Zellrezeptors 41
3.2.1. Zytokinrepertoire nativer aß T-Zellen im Transkriptom 41
3.2.2 Zytokinrepertoire des Transkriptoms von aß T-Zellen nach
Kokultur mit Neuroblastomzellen 41
3.3. Häufigkeitsverteilung der 5- und y-Ketten im y8 T-Zellrezeptor 43
3.4. Zytokinprofil im Transkriptom nativer y8 T-Zellen, IL-2/PHA-
expandierter und mit Neuroblastomzellen kokultivierter y8 T-Zellen .44
3.4.1. Zytokinrepertoire nativer y5 T-Zellen 44
3.4.2. Zytokinprofil von y8 T-Zellen nach IL-2/PHA-Expansion 47
3.4.3. Zytokinprofil von y8 T-Zellen nach IL-2/PHA-Expansion und
anschließender Kokultur mit Neuroblastomzellen auf Trans¬
kriptionsebene 51
3.5. Zytokinprofil des Transkriptoms der y8 T-Zellen nach Expansion
mit PAM/IL-2/PHA und nach Kokultur mit Neuroblastomzellen 53
3.5.1. Genexpressionen der y8 T-Zellen nach PAM/IL-2/PHA-Expansion .53
3.5.2. Zytokinprofil desTranskriptoms von y8 T-Zellen nach Expansion
mit PAM/IL-2/PHA und Kokultur mit Neuroblastomzellen 56
3.6. Genexpressionen des nativen TH1-Typs auf mRNA- und
Protein-Ebene 62
3.7. Gegenüberstellung des Zytokinrepertoires auf Proteinebene
von IL-2/PHA und PAM/IL-2/PHA expandierten y8's mit und
ohne Neuroblastom-Challenge 65
3.8. Zusammenfassung der Ergebnisse 68
III
4. DISKUSSION 70
4.1. Zytokinprofil nativer y5 T-Zellen 71
4.2. Expression von Apoptose-induzierenden Markern auf
y8 T-Zellen 73
4.3. Expression von GranzymeB/Perforin in y6 T-Zellen 75
4.4. Einfluss von Bisphosphonaten auf das Zytokinprofil der
y5 T-Zellen 75
4.5. Paarung der Ketten des TCR 79
4.6. Regulatorische Potenz der y8 T-Zellen 82
5. ZUSAMMENFASSUNG 90
6. LITERATURVERZEICHNIS 93
6.1. Journals 93
6.2. Bücher 107
7. ANHANG 108
8. DANKSAGUNG 115
9. LEBENSLAUF 116
IV
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 1: Entwicklung der zellulären Komponenten des Immunsystems 4
Abb. 2: Zytokinprofil 5 verschiedener, nativer Neuroblastomzelllinien
im Vergleich 38
Abb. 3: Genexpressionen der Neuroblastomzelllinie LS nativ, nach
Bestrahlung mit 30 und 50 Gy sowie nach Stimulierung mit IFNy 40
Abb. 4: Zytokinprofil CD4+ aß T-Zellen und CD8+ aß T-Zellen
auf Transkriptomebene im Vergleich 41
Abb. 5: Zytokinprofil CD4* aß T-Zellen nativ und nach Kokultur mit
Neuroblastomzellen der Linie LS auf Transkriptomebene 42
Abb. 6: Transkriptom CD8+ aß T-Zellen nativ und nach Kokultur mit
Neuroblastomzellen 43
Abb. 7: Transkriptom der y5 T-Zellen des TH1-Typs (Sp 5), TH2-Typs
(Sp 1+2) und TH1/TH2-Mischtyps (Sp 3,4,6,7,8) im nativen
Zustand 46
Abb. 8: Genexpressionen der y8 T-Zellen des TH1-Typs nativ (n=1)
und nach Expansion mit IL-2/PHA über 14-21 Tage (n=1) 47
Abb. 9: Genexpression der y8 T-Zellen des TH2 (n=2) Typs im Vergleich
nativ und nach Expansion über 14-21 Tage mit IL-2/PHA (n=2) 48
Abb. 10: Vergleich der Genexpressionen der yS T-Zellen des TH1/TH2-
Mischtyps im nativen Zustand (n=5) und nach Expansion mit
IL-2/PHA über 14-21 Tage (n=2) 49
Abb. 11: Genexpressionen der y5 T-Zellen des nativen TH1-Typs (n=1),
TH2-Typs (n=2) sowie des TH1/TH2-Mischtyps (n=2) nach
Expansion mit IL-2/PHA über 14-21 Tage im Vergleich 50
Abb. 12: y8 T-Zellen des nativen TH1-Typs (n=1) nach Expansion mit
IL-2/PHA und Kokultur mit Neuroblastomzellen auf Ebene der
Transkription. Nur dargestellte Zytokine untersucht 51
Abb. 13: y8 T-Zellen des nativen TH2-Typs (n=2) nach Expansion über
14-21 Tage mit IL-2/PHA sowie nach Expansion und Kokultur
mit Neuroblastomzellen auf Transkriptionsebene 52
Abb. 14: Vergleich der Genexpressionen der y5 T-Zellen des nativen
TH1/TH2-Mischtyps nach Expansion mit IL-2/PHA über
14-21 Tage (n=2) sowie nach Expansion und Kokultur mit
Neuroblastomzellen (n=2) auf Transkriptionsebene 53
Abb. 15: Genexpressionen der yS T-Zellen des TH1/TH2-Mischtyps
nativ (n=5) und nach Expansion über 14-21 Tage mit
PAM/IL-2/PHA (n=3) auf Transkriptionsebene 54
Abb. 16: Genexpressionen der y5 T-Zellen des TH1-Typs nativ (n=1)
und nach Expansion mit PAM/IL-2/PHA (n=1) auf Trans¬
kriptionsebene 55
Abb. 17: Genexpressionen der y8 T-Zellen des nativen TH1-Typs (n=1)
nach Expansion mit PAM/IL-2/PHA und nach Expansion
und Kokultur mit Neuroblastomzellen auf Transkriptomebene 57
V
Abb. 18: Transkriptom der y5 T-Zellen des nativen TH1/TH2-Mischtyps
nach Expansion über 14-21 Tage mit PAM/IL-2/PHA (n=3) und
nach Expansion und Kokulturmit Neuroblastomzellen (n=3) 58
Abb. 19: Transkriptom von y8 T-Zellen des nativen TH1-Typs, nach
Expansion mit PAM/IL-2/PHA, sowie nach IL-2/PHA-Expansion 59
Abb. 20: Transkriptom von nativ TH1-Typ-y8 T-Zellen nach Expansion
mit IL-2/PHA, PAM/IL-2/PHA sowie nach Kokultur mit Neuro¬
blastomzellen 59
Abb. 21: Zytokinrepertoire der yS T-Zellen des TH1-Typs nach Expansion
mit IL-2/PHA auf Protein- und Transkriptionsebene im Vergleich 63
Abb. 22: Zytokinrepertoire der y5 T-Zellen des TH1-Typs auf Trans¬
kriptions- und Proteinebene nach Expansion mit IL-2/PHA und
Kokultur mit Neuroblastomzellen der Linie LS im Vergleich 63
Abb. 23: Zytokinrepertoire der y8 T-Zellen des TH-1-Typs nach Expansion
mit PAM/IL-2/PHA auf Protein- und Transkriptionsebene im
Vergleich 64
Abb. 24: Zytokinrepertoire der yS T-Zellen des TH1-Typs auf Transkriptions¬
und Proteinebene nach Expansion mit PAM/IL-2/PHA und Kokultur
mit Neuroblastomzellen im Vergleich 65
Abb. 25: Proteinrelease der y8 T-Zellen des nativen TH1-Typs nach
Expansion mit IL-2/PHA und PAM/IL-2/PHA 66
Abb. 26: Proteinrelease der y5 T-Zellen des nativen TH1-Typs
nach Expansion mit IL-2/PHA bzw. PAM/IL-2/PHA und
anschließender Kokultur mit Neuroblastomzellen der Linie LS 67
Abb. 27: Proteinrelease der y8 T-Zellen des nativen TH1-Typs
nach Expansion mit IL-2/PHA bzw. PAM/IL-2/PHA sowie
Expansion nach beiden Modi und anschließender Kokultur
mit Neuroblastomzellen 67 |
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