Strukturelle und funktionelle Aspekte der Metall-induzierten Oligomerisierung von APP, APLP1 und APLP2:
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2013
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INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG 1
SUMMARY 3
1. EINLEITUNG 5
1.1. DIE ALZHEIMER-KRANKHEIT 5
1.2. DAS A/3-PEPTID ALS MOLEKULARE URSACHE DER ALZHEIMER-KRANKHEIT 6
1.3. DIE APP-GEN-FAMILIE 8
1.3.1. STRUKTUR UND LOKALISATION VON APP, APLP1 UND APLP2 8
1.3.2. PHYSIOLOGISCHE FUNKTIONEN VON APP, APLP1 UND APLP2 11
1.4. ZIELSETZUNG 14
2. ERGEBNISSE 15
2.1. ZINK- UND KUPFERIONEN INDUZIEREN DIE BILDUNG VON APLP1- UND
APLP2-CLUSTERN 15
2.2. EINFLUSS VON ZINK AUF DIE OLIGOMERISIERUNG VON APP, APLP1 UND APLP2
. . 17
2.2.1. EINFLUSS VON ZINK AUF DIE LOKALISATION VON APLP1 IN NEURONEN ....
17
2.2.2. EINFLUSS VON ZINK AUF DIE OLIGOMERISIERUNG VON APLP1 18
2.2.3. EINFLUSS VON EISEN AUF DIE OLIGOMERISIERUNG VON APLP1 20
2.2.4. QUANTITATIVE ANALYSE DER ZINK-INDUZIERTEN OLIGOMERISIERUNG 20
2.2.5. ZINK-INDUZIERTE HETEROOLIGOMERISIERUNG VON APP, APLP1 UND APLP2
22
2.3. LOKALISATION DER ZINKBINDUNGSSTELLE IN APLP1 23
2.3.1. EINGRENZUNG DER KRITISCHEN REGION FUER DIE OLIGOMERISIERUNG VON
APLP1 23
2.3.2. IDENTIFIZIERUNG DER ZINK-BINDENDEN REGION VON APLP1 25
2.4. UNTERSUCHUNG DER METALLBINDUNGSEIGENSCHAFTEN DER E2-DOMAENE 28
2.4.1. HETEROLOGE PRODUKTION VON APLP1 E2 28
2.4.2. HERSTELLUNG VON POLYKLONALEN ANTIKOERPERN GEGEN DIE E2-DOMAENEN VON
APP, APLP1 UND APLP2 30
2.4.3. UNTERSUCHUNG DER BINDUNG VON METALLIONEN AN APP E2 30
V
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IMAGE 2
2.4.4. UNTERSUCHUNG DER BINDUNG VON ZINKIONEN AN DIE E2-DOMAENEN VON
APP, APLP1 UND APLP2 33
2.4.5. UNTERSUCHUNG DER BINDUNG VON KUPFERIONEN AN DIE E2-DOMAENEN VON
APP, APLP1 UND APLP2 35
2.4.6. EINFLUSS VON ZINK AUF DIE OLIGOMERISIERUNG DER E2-DOMAENEN VON
APP,
APLP1 UND APLP2 35
2.5. EINFLUSS VON ZINK AUF DIE IRANS-OLIGOMERISIERUNG VON APLP1 39
2.6. EXPRESSION UND OLIGOMERANALYSE DER EL-DOMAENE VON APLP1 41
2.6.1. EXPRESSION DER EL-DOMAENE VON APLP1 41
2.6.2. UNTERSUCHUNG DER OLIGOMERISIERUNG VON APLP1 EL 42
3. DISKUSSION 43
3.1. APP, APLP1 UND APLP2 ALS ZINK-ABHAENGIGE OLIGOMERE IM GEHIRN 43
3.2. DIE E2-DOMAENE ALS SENSOR FUER METALLIONEN 45
3.2.1. LOKALISATION DER ZINKBINDUNGSSTELLE FUER DIE ZINK-ABHAENGIGE
OLIGOMERI
SIERUNG 45
3.2.2. KONFORMATIONSAENDERUNGEN IN DER E2-DOMAENE DURCH DIE BINDUNG VON
METALLIONEN 46
3.2.3. ZINK-ABHAENGIGE OLIGOMERISIERUNG VON APLP1 UEBER EINE NEUE ZINKBIN
DUNGSSTELLE IN DER E2-DOMAENE 48
3.3. APP UND APLPS ALS ZINK-ABHAENGIGE PROTEINE DER EXTRAZELLULAEREN
MATRIX ... 49
3.4. APP UND APLPS ALS SYNAPTISCHE ADHAESIONSPROTEINE 50
4. MATERIAL UND METHODEN 55
4.1. MATERIAL 55
4.1.1. CHEMIKALIEN, PROTEINE UND KITS 55
4.1.2. PUFFERLOESUNGEN 55
4.1.3. ANTIKOERPER 55
4.1.4. PRIMER 56
4.1.5. PLASMIDVEKTOREN UND EXPRESSIONSKONSTRUKTE 57
4.1.6. BAKTERIENSTAEMME UND NAEHRMEDIEN 57
4.1.7. HEFESTAEMME UND NAEHRMEDIEN 58
4.1.8. ZELLLINIEN 58
4.1.9. VERSUCHSTIERE 59
4.1.10. VERBRAUCHSMATERIALIEN 59
4.1.11. GERAETE 59
VI
IMAGE 3
4.1.12. SOFTWARE 61
4.2. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 62
4.2.1. KLONIERUNGSSTRATEGIEN 62
4.2.2. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 63
4.2.3. SPALTUNG UND LIGATION VON DNA 64
4.2.4. TOPO-KLONIERUNG 64
4.2.5. TRANSFORMATION VON KOMPETENTEN ZELLEN DURCH HITZESCHOCK 64
4.2.6. VERVIELFAELTIGUNG, PRAEPARATION UND KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON
PLASMIDDNA 65
4.2.7. DNA-GELELEKTROPHORESE UND REINIGUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN . .
65
4.2.8. SEQUENZIERUNG UND PLASMIDKONTROLLEN 66
4.3. PROTEINEXPRESSION IN ESCHERICHIA COLI UND PICHIA PASTORIS : 66
4.3.1. PROTEINEXPRESSION IN E. COLI UND AUFSCHLUSS DER BAKTERIENZELLEN
.... 66
4.3.2. PROTEINEXPRESSION IN P. PASTORIS 66
4.4. CHROMATOGRAPHISCHE VERFAHREN 68
4.4.1. AUFREINIGUNGSSTRATEGIEN 68
4.4.2. AFFINITAETSCHROMATOGRAFIE MIT HEPARIN 69
4.4.3. AFFINITAETSCHROMATOGRAFIE MIT BLUE-SEPHAROSE 69
4.4.4. LEKTINAFFINITAETSCHROMATOGRAFIE 69
4.4.5. KUPFER-IMAC 69
4.4.6. ZINK-IMAC MIT PROTEOLYTISCHEM VERDAU 70
4.4.7. AFFINITAETSCHROMATOGRAFIE MIT PROTEIN A 70
4.4.8. GROESSENAUSSCHLUSSCHROMATOGRAFIE (SEC) 71
4.5. MASSENSPEKTROMETRISCHE ANALYSE VON PROTEINEN 72
4.5.1. ENTSALZUNG UND AUFKONZENTRIERUNG DER PROBE 72
4.5.2. PROBENVORBEREITUNG UND MESSUNG 72
4.6. PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 72
4.6.1. PEPTIDSYNTHESE 72
4.6.2. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINLOESUNGEN 72
4.6.3. SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 73
4.6.4. NACHWEIS VON PROTEINEN IN POLYACRYLAMIDGELEN MIT COOMASSIE 73
4.6.5. WESTERN-BLOT 73
4.7. SPEKTROSKOPISCHE METHODEN 74
4.7.1. CIRCULARDICHROISMUS-MESSUNGEN 74
4.7.2. OBERFLAECHENPLASMONRESONANZ-ANALYSEN 74
VII
IMAGE 4
4.8. KULTIVIERUNG VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN 75
4.8.1. HEK293-ZELLEN 75
4.8.2. PRIMAERE NEURONEN 76
4.9. PRODUKTION VON POLYKLONALEN ANTIKOERPERN 77
4.9.1. AUSWAHL UND PRAEPARATION DER ANTIGENE 77
4.9.2. IMMUNISIERUNG UND GEWINNUNG DER ANTISEREN 77
4.10. FLUORESZENZMIKROSKOPIE UND FRET-MESSUNGEN 78
4.10.1. LSM-MESSUNGEN 78
4.10.2. MESSUNG VON FLUORESZENZ IN ZELLKONTAKTEN 78
4.10.3. FRET-MESSUNGEN 78
4.11. STATISTISCHE ANALYSEN 79
LITERATURVERZEICHNIS 81
A. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 97
B. PUBLIKATIONEN 101
C. LEBENSLAUF 103
D. DANKSAGUNG 105
E. ERKLAERUNG DER SELBSTSTAENDIGKEIT 107
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