Transduktion der humanen Myelomzelllinie LP1 mit den kostimulatorischen Molekülen B7-1 und B7-2 und deren Bedeutung für die T-Zell-Antwort in vitro:
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1
MORTALITAET,
PRAEVENTION
UND
THERAPIE
VON
KREBSERKRANKUNGEN
1
1.2
NON-HODGKIN-LYMPHOME
(NHL)
3
1.2.1
EPIDEMIOLOGIE
UND
KLINIK
DER
NHL
3
1.2.2
KLASSIFIKATION
UND
STADIENEINTEILUNG
DER
NHL
4
1.2.3
THERAPIE
UND
PROGNOSE
DER
NHL
4
13
DIE
ROLLE
DES
IMMUNSYSTEMS
IN
DER
TUMORABWEHR
-
NEUE
THERAPEUTISCHE
KONZEPTE
BEI
NHL
7
1.4
DAS
PRINZIP
DER
SPEZIFISCHEN
IMMUNREAKTION
8
1.4.1
DIE
BEDEUTUNG
KOSTIMULATORISCHER
MOLEKUELE
IM
RAHMEN
DER
IMMUNREAKTION
9
1.4.1.1
CD28
10
1.4.1.2
CTLA-4
10
1.4.1.3
DIE
B7-MOLEKUELE
-
STRUKTUR,
BINDUNGSPARTNER
UND
VORKOMMEN
11
1.4.1.4
INTERAKTION
ZWISCHEN
CD28,
CTLA-4
UND
DEN
B7-MOLEKUELEN
IM
VERLAUF
DER
IMMUNREAKTION
13
L.S
VERSTAERKUNG
DER
IMMUNANTWORT
DURCH
EXPRESSION
KOSTIMULATORISCHER
MOLEKUELE
AUF
TUMORZELLEN
-
DAS
KONZEPT
DER
B7-TUMORVAKZINE
14
1.6
DAS
ADENO-ASSOZIIERTE-VIRUS-VEKTOR-SYSTEM
ALS
GENTRANSFERSYSTEM
16
1.7
ZIELE DER
ARBEIT
18
2.
MATERIAL
19
2.1
ANTIKOERPER
19
2.2
ZELLINIEN
19
23
BAKTERIENSTAEMME
20
2.4
PLASMIDE
20
2.5
ENZYME
20
2.6
CHEMIKALIEN,
GERAETE
UND
ANDERE
MATERIALIEN
20
3.
METHODEN
23
3.1
BEARBEITUNG
VON
DNA
23
3.1.1
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
AN
DNA
23
3.1.1.1
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
23
3.1.1.2
ABSPALTUNG
VON
5'PHOSPHATEN
DURCH
ALKALISCHE
PHOSPHATASE
23
3.1.1.3
HERSTELLUNG
GLATTER
ENDEN
MIT
T4-DNA-POLYMERASE
23
3.1.1.4
AUFFULLEN
UEBERHAENGENDER
5'-ENDEN
MIT
KLENOW-FRAGMENT
24
3.1.1.5
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
IN
VEKTOREN
24
3.1.1.6
FAELLUNG
VON
DNA
MIT
ETHANOL
24
3.1.1.7
PHENOLEXTRAKTION
VON
PROTEINEN
25
3.1.2
ANALYSE
VON
DNA
25
3.1.2.1
AUFTRENNUNG
VON
DNA
UEBER
AGAROSE-GELE
25
3.1.2.2
DNA-SEQUENZIERUNG
26
3.1.3
PLASMIDISOLIERUNG
UEBER
QIAGEN-SAEULEN
27
3.2
HERSTELLUNG
VON
RAAV-VEKTOREN
28
3.2.1
VERWENDETE
PLASMIDE
28
3.2.2
ELEKTROPORATION
VON
COS-7-ZELLEN
29
3.2.3
AAV-VERPACKUNG
30
3.3
KLONIEREN
VON
DNA
IN
E.
COLI
32
3.3.1
BAKTERIENKULTUREN
32
3.3.1.1
ANZUCHT
AUF
AGARPLATTEN
32
3.3.1.2
VERMEHRUNG
VON
BAKTERIEN
IN
FLUESSIGKULTUREN
32
3.3.2
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
ZELLEN
33
3.3.3
STAMMHALTUNG
34
3.3.4
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
34
3.4
ZELLKULTUR
(EUKARYOTISCHER
ZELLEN)
34
3.4.1
AUFTAUEN
KRYOKONSERVIERTER
ZELLEN
34
3.4.2
BESTIMMUNG
DER
ZELLZAHL
34
3.4.3
EINFRIEREN
VON
ZELLEN
35
3.4.4
KULTURBEDINGUNGEN
35
3.5
GEWINNUNG
MONONUKLEAERER
ZELLEN
MIT
DICHTEGRADIENTEN-ZENTRIFUGATION
36
3.6
SELEKTION
VON
ZELLEN
36
3.6.1
SELEKTION
DURCH
RESISTENZ
36
3.6.2
ELIMINATION
VON
MAKROPHAGEN
MITTELS
L-LEUCINMETHYLESTER
(LLME)
36
3.6.3
SELEKTION
DURCH
MAGNETIC
ADSORBENT
CELL
SORTING
(MACS)
36
3.7
ANALYSE
DER
LYMPHOZYTENPOPULATION
MITTELS
FLUORESCENCE
ACTIVATED
CELL
SCANNER
(FACSCAN)
37
3.8
BESTRAHLUNG
VON
LPL-ZELLEN
37
3.9
PROLIFERATIONSASSAY
38
4.
ERGEBNISSE
39
4.1
AAV-SYSTEM
39
4.1.2
HERSTELLUNG
INFEKTIOESER
AAV-PARTIKEL
39
4.2
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
VON
B7-2
MITTELS
FACSCAN
40
4.2.1
ANREICHERUNG
B7
1
ODER
B7-2
POSITIVER
ZELLEN
MIT
MAGNETIC
ADSORBENT
CELL
SORTING
(MACS)
42
43
NACHWEIS
DER
KOSTIMULATORISCHEN
FUNKTION
VON
B7-1
UND
B7-2
IN
VITRO
42
4.3.1
VORVERSUCHE
43
4.3.1.1
VORVERSUCH
ZUR
T-ZELL-SELEKTION
IM
MACS-VERFAHREN
43
4.3.1.2
VORVERSUCH
ZUR
GEWINNUNG
VON
T-LYMPHOZYTEN:
STEIGERN
DES
ANTEILS
DER
T-ZELLEN
EINER
LEUKOZYTENPOPULATION
DURCH
MACS
43
4.3.1.3
VORVERSUCH
ZUR
T-ZELLPROLIFERATION:
BESTIMMUNG
DER
SUBOPTIMALEN
STIMULATION
HUMANER
T-ZELLEN
DURCH
CONCANAVALIN
A
45
4.3.1.4
VORVERSUCH
ZUR
B7-BLOCKADE
MIT
MAB:
TITRATION
DES
MABB7-2
46
4.3.2
LP1/B7-1
UND
LP1/B7-2
STEIGERN
DIE
T-ZELL-PROLIFERATION
IN
VITRO
47
4.4
WEITERE
VERSUCHE
ZU
B7-1
UND
B7-2
IN
VITRO
48
4.4.1
KOMBINATIONEN
B7-1
POSITIVER
MIT
B7-2
POSITIVEN
ZELLEN
FOERDERN
DIE
T-ZELL
PROLIFERATION
NICHT
ZUSAETZLICH
48
4.4.2
AUCH
GERINGE
MENGEN
B7-1
UND
B7-2-POSITIVER
LP1
ZELLEN
STIMULIEREN
T-ZELLEN
49
4.4.3.1
TRANSDUKTION
EINER
PAAV/B7-L
POSITIVEN
ZELLPOPULATION
MIT
PAAV/B7-2
50
4.4.3.2
WERDEN
B7-1
UND
B7-2
AUF
DERSELBEN
ZELLOBERFLAECHE
EXPRIMIERT,
ERGEBEN
SICH
HOEHERE
(ABER
NICHT
SIGNIFIKANTE)
WACHSTUMSRATEN,
ALS
DURCH
EIN
GEMISCH
AUS
B7-1
UND
B7-2
POSITIVEN
ZELLEN
50
5.
DISKUSSION
52
5.1
METHODENDISKUSSION
52
5.1.1
GENTRANSFER
IN
HUMANE
ZELLEN
MIT
HILFE
DES
AAV-VEKTOR-SYSTEMS
52
5.1.2
LPL-ZELLEN
54
5.1.3
BESTRAHLUNG
VON
LPL-ZELLEN
55
5.1.4
ZEITLICHER
VERLAUF
DER
EXPRESSION
DER
MIT
AAV
TRANSDUZIERTEN
GENE
IN
LPL-ZELLEN
55
5.1.5
UEBERPRUEFUNG
DER
T-ZELL-ANTWORT
IM
PROLIFERATIONSASSAY
56
5.2
ERGEBNISDISKUSSION
57
53
WEITERE
PERSPEKTIVEN
60
6.
ZUSAMMENFASSUNG
63
7.
LITERATURVERZEICHNIS
64
8.
VERZEICHNIS
DER
VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN
72
9.
DANKSAGUNG
74
10.
EIGENE
VEROEFFENTLICHUNGEN
ZUM
THEMA
75
11.
CURRICULUM
VITAE
76 |
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