Biosynthese und Interaktionen von Biglycan:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2001
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| Beschreibung: | Münster, Univ., Diss., 2001 |
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I
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 KLEINE LEUCIN-REICHE PROTEOGLYKANE 1
1.1.1 STRUKTURELLE MERKMALE VON BIGLYCAN UND DECORIN 4
1.1.2 INTERAKTIONEN VON BIGLYCAN 6
1.1.2.1 INTERAKTIONEN VON BIGLYCAN MIT KOLLAGENEN 7
1.1.2.2 INTERAKTIONEN VON BIGLYCAN MIT TGF-SS 8
1.1.2.3 INTERAKTIONEN VON BIGLYCAN MIT SERUMBESTANDTEILEN UND
ANDEREN KOMPONENTEN DER EXTRAZELLULAEREN MATRIX 9
1.1.3 ENDOZYTOSE KLEINER LEUCIN-REICHER PROTEOGLYKANE 10
2 PROBLEMSTELLUNG - 12
3 ERGEBNISSE 14
3.1 UEBERSICHT UEBER DIE VERWENDETEN REKOMBINANTEN BIGLYCAN-
KONSTRUKTE
14
3.2 EXPRESSION VON REKOMBINANTEM BIGLYCAN IN EINEM
PROKARYONTISCHEN EXPRESSIONSSYSTEM 16
3.2.1 ERZEUGUNG DES BIGLYCAN-KONSTRUKTES MITTELS RT-PCR 16
3.2.2 KLONIERUNG DES BIGLYCAN-KONSTRUKTES IN DEN VEKTOR PET-
22B(+)
16
3.2.3 EXPRESSION DES REKOMBINANTEN BIGLYCANS 17
3.3 PRAEPARATIVE DARSTELLUNG DES REKOMBINANTEN BIGLYCANS AUS
PROKARYONTEN 19
3.4 EXPRESSION VON REKOMBINANTEM BIGLYCAN IN EINEM
EUKARYONTISCHEN EXPRESSIONSSYSTEM 22
3.4.1 ERZEUGUNG DER CDNA VON BIGLYCAN MITTELS RT-PCR 22
3.4.2 KLONIERUNG DER CDNA VON BIGLYCAN IN DEN VEKTOR
PCDNA3.1(+)
22
3.4.3 STABILE TRANSFEKTION VON HEK 293-ZELLEN 23
3.5 UNTERSUCHUNG DER ANHEFTUNG DER GLYKOSAMINOGLYKAN-KETTEN AN
DAS ZENTRALFILAMENT VON BIGLYCAN 26
3.5.1 ERZEUGUNG DER BIGLYCAN-MUTANTEN MITTELS PCR 26
3.5.2 EXPRESSION DER BIGLYCAN-MUTANTEN 26
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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II
3.5.3 EINFLUSS VON P-NITROPHENYL-SS-D-XYLOSID AUF DIE ANHEFTUNG DER
GLYKOSAMINOGLYKAN-KETTE 28
3.6 PRAEPARATIVE DARSTELLUNG DES REKOMBINANTEN BIGLYCANS AUS HEK
293-ZELLEN 31
3.7 CHARAKTERISIERUNG DES REKOMBINANTEN BIGLYCANS 34
3.7.1 UNTERSUCHUNG DER PROTEINSEQUENZ DES REKOMBINANTEN BIGLYCANS 34
3.7.2 ZUSAMMENSETZUNG DER GLYKOSAMINOGLYKAN-KETTEN 35
3.8 REZEPTOR-VERMITTELTE ENDOZYTOSE VON BIGLYCAN 37
3.8.1 EINSATZ VON REKOMBINANTEM BIGLYCAN AUS PROKARYONTEN BEI DER
ENDOZYTOSE VON [35S]SULFAT-MARKIERTEM DECORIN 37
3.8.2 ENDOZYTOSE VON REKOMBINANTEM BIGLYCAN AUS HEK 293-ZELLEN 38
3.9 INTERAKTIONEN VON BIGLYCAN MIT KOLLAGEN TYP V 41
3.9.1 INTERAKTION VON REKOMBINANTEM BIGLYCAN AUS PROKARYONTEN MIT
KOLLAGEN TYP V 41
3.9.2 INTERAKTION VON REKOMBINANTEM BIGLYCAN AUS HEK 293-ZELLEN
MIT KOLLAGEN TYP V 41
3.10 DARSTELLUNG BIGLYCAN-BINDENDER PROTEINE 48
3.10.1 KOPPLUNG VON BIGLYCAN AN DEN CROSSLINKER SULFO-SBED 50
3.10.2 SUCHE NACH BIGLYCAN-BINDENDEN PROTEINEN 51
4 DISKUSSION
4.1 VERGLEICH EINES PROKARYONTISCHEN UND EINES EUKARYONTISCHEN
EXPRESSIONSSYSTEMS
53
4.2 UNTERSCHIEDLICHE NUTZUNG DER GLYKOSAMINOGLYKAN-
ANHEFTUNGSSTELLEN VON BIGLYCAN 55
4.3 ENDOZYTOSE VON BIGLYCAN 59
4.4 BINDUNG VON BIGLYCAN AN KOLLAGEN TYP V 61
4.5 BIGLYCAN-BINDENDE PROTEINE 63
5 ZUSAMMENFASSUNG
65
6 MATERIAL UND METHODEN
67
6.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN
67
6.1.1 LOESUNGEN FUER DIE ZELLKULTUR 67
6.1.2 TRANSFEKTION EUKARYONTISCHER ZELLEN 68
6.1.3 METABOLISCHE MARKIERUNG VON ZELLEN 69
6.1.4 ENDOZYTOSE 69
III
6.2 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 71
6.2.1 KULTURMEDIEN 71
6.2.2 HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIEN 72
6.2.3 EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE IN BAKTERIEN 72
6.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 74
6.3.1 ISOLIERUNG VON DNA 74
6.3.2 REVERSE TRANSKRIPTION 74
6.3.3 AMPLIFIZIERUNG EINES DEFINIERTEN GENABSCHNITTES MITTELS PCR 74
6.3.3.1 MUTAGENESE MITTELS PCR 76
6.3.4 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 78
6.3.5 EXTRAKTION VON DNA AUS AGAROSEGELEN 79
6.3.6 RESTRIKTION VON DNA MIT ENDONUKLEASEN 79
6.3.7 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 79
6.3.8 TRANSFORMATION REKOMBINANTER PLASMID-DNA - 80
6.3.9 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 80
6.3.10 SEQUENZIERUNG VON DNA 80
6.3.11 ANALYSE VON DNA 81
6.3.11.1 DENATURIERENDE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON RNA 81
6.3.11.2 NORTHEM-BLOT 81
6.3.11.3 HYBRIDISIERUNG DER MEMBRANGEBUNDENEN RNA MIT EINER
32
P-MARKIERTEN DNA-SONDE 81
6.4 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 83
6.4.1 PRAEPARATIVE REINIGUNG VON REKOMBINANTEM BIGLYCAN AUS 83
BAKTERIEN
6.4.1.1 EXTRAKTION VOMPROTEINEN AUS DEM PERIPLASMATISCHEN RAUM
VON BAKTERIEN 83
6.4.1.2 REINIGUNG MITTELS METALLCHELAT-CHROMATOGRAPHIE 83
6.4.2 PRAEPARATIVE REINIGUNG VON PROTEOGLYKANEN 84
6.4.2.1 ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE AN DEAE-TRI^ACRYL M 84
6.4.2.2 ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE MITTELS HPLC 85
6.4.3 PRAEPARATIVE REINIGUNG VON REKOMBINANTEM BIGLYCAN AUS HEK
293-ZELLEN 86
6.4.3.1 ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE AN DEAE-TRISACRYL M 86
6.4.3.2 HYDROPHOBE INTERAKTIONS-CHROMATOGRAPHIE AN PHENYL-
SEPHAROSE CL-4B 86
6.4.4 BESTIMMUNG DES GESAMTPROTEINGEHALTES 87
6.4.5 IMMUNPRAEZIPITATION 88
6.4.6 ENZYMATISCHE SPALTUNGEN 89
6.4.6.1 ABBAU MIT CHONDROITIN-LYASEN 89
IV
6.4.6.2 ABBAU MIT ENDOGLYKOSIDASE F 90
6.4.6.3 ABBAU MIT HEPARINASE I UND III 90
6.4.7 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 91
6.4.8 SILBERFARBUNG VON POLYACRYLAMIDGELEN 92
6.4.9 FLUOROGRAPHIE 93
6.4.10 WESTEM-BLOT 93
6.4.11 IMMUNCHEMISCHER NACHWEIS MEMBRANGEBUNDENER PROTEINE 94
6.4.12 CHEMILUMINESZENZDETEKTION MEMBRANGEBUNDENER PROTEINE 95
6.4.13 IMMUNFARBUNG VON ZELLEN 95
6.4.14 FESTPHASEN-BINDUNGSASSAY 96
6.4.15 ENZYMGEBUNDENER IMMUNADSORPTIONSTEST (ELISA) 96
6.4.16 DARSTELLUNG BIGLYCAN-BINDENDER PROTEINE 97
6.4.16.1 KOPPLUNG VON BIGLYCAN AN EINEN CROSSLINKER 97
6.4.16.2 NACHWEIS BIGLYCAN-BINDENDER PROTEINE DIREKT AN ZELLEN 98
6.4.16.3 LIGANDENBLOT 98
6.4.17 SEQUENZIERUNG VON PROTEINEN 99
6.5 GERAETE UND MATERIALIEN 100
6.5.1 GERAETE 100
6.5.2 MATERIALIEN 100
7 LITERATURVERZEICHNIS
102
ABKUERZUNGEN
V
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
VII
T
ABEILEN VERZEICHNIS
IX |
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