Entwicklung und Charakterisierung eines liposomalen Hybridvektors zur antiangiogenen Gentherapie von Tumorerkrankungen:
Gespeichert in:
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| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Marburg
Görich & Weiershäuser
2000
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| Schriftenreihe: | Wissenschaft in Dissertationen
599 |
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| Beschreibung: | Zugl.: Marburg, Univ., Diss., 2000 |
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
1 Einfuhrung, Ziel und Aufbau der Arbeit 2
2 Gentherapie Ansätze und Methoden 3
2.1 Die somatische Gentherapie 3
2.2 Gentherapie von Krebserkrankungen 3
2.3 Die Krebsentstehung und mögliche Therapieansätze 4
2.3.1 Mutationskompensation 5
2.3.2 Molekulare Chemotherapie 6
2.3.3 Antiangiogenese 6
2.3.4 Zelladhäsion, Apoptose und genetische Immunpotenzierung 7
2.4 Vektoren 8
2.4.1 Mechanische und physikalische Methoden 9
2.4.2 Biologische Methoden, virale Vektoren 9
2.4.3 Chemische Methoden, nichtvirale Vektoren 10
2.4.3.1 Liposomen 11
2.4.3.2 Kationische Lipide 12
2.4.3.3 Polymere und Polypeptide 13
2.4.4 Hybride verschiedener Vektoren 13
2.4.4.1 Hybride aus viralen Vektoren 13
2.4.4.2 Hybride aus nichtviralen Vektoren 14
2.4.4.2.1 Hybride kationischer Verbindungen 14
2.4.4.2.2 Hybride anionischer und kationischer Verbindungen 15
2.5 Barrieren des vektorvermittelten Gentransfers 15
2.5.1 Körperflüssigkeiten, Blut 16
2.5.2 Aufnahme in die Zelle 16
2.5.3 Freisetzung aus dem Endosom 16
2.5.4 Der Weg in den Nukleus 17
2.6 Zusammenfassung 18
2.7 Literatur 18
3 Entwicklung einer biophysikalischen Methode zur Optimierung der
Lipidzusammensetzung von Liposomen 26
3.1 Supramolekulare Systeme 26
3.2 Modellmembranen 26
3.2.1 Modellmembranen zur Simulation von Biomembranen 26
3.2.2 Modellmembranen zur Simulation von artifiziellen Membranen 27
3.3 Optimierung der Zusammensetzung von OPP Liposomen 27
3.3.1 OPP Liposomen in der Krebstherapie 28
3.3.2 Zusammensetzung der OPP Liposomen 30
3.3.3 Geräte 30
3.3.4 Material 31
3.3.5 Methoden 31
3.3.5.1 Herstellung der Liposomen 31
3.3.5.2 Fluoreszenzmessungen 31
3.3.5.2.1 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 33
3.3.5.2.2Calceinfreisetzung 34
3.3.5.2.3Carboxyfluoresceinfreisetzung 35
I
Inhaltsverzeichnis
3.3.5.3 Zellkulturuntersuchungen mit OPP Liposomen 35
3.3.5.4 Untersuchungen an der Luft Wassergrenzschicht 36
3.3.5.4.1 Die Filmwaage 37
3.3.5.4.2Der Einbau in Phospholipidmonolayer 39
3.3.5.4.3Durchführung der Monolayerexperimente 41
3.3.5.5 Bestimmung der hämolytischen Aktivität in vivo 42
3.4 Resultate 43
3.4.1 Fluoreszenzassays 43
3.4.1.1 FRET (fluorescence resonance energy transfer) 43
3.4.1.2 Calceinfreisetzung 44
3.4.1.3 Carboxyfluorescein Freisetzung 45
3.4.2 Zellkulturuntersuchungen mit OPP Liposomen 46
3.4.3 DieHämolyse 47
3.4.4 Monolayer Messungen 48
3.4.4.1 Isothermen 48
3.4.4.2 Einbauversuche 53
3.4.4.2.1 Monolayer mit OPP Lipidmischungen 53
3.4.4.2.2Monolayermit Chol+PE+PS+PC (Targetmembran) 55
3.5 Diskussion 56
3.5.1 Fluoreszenzmessungen und Zellkulturdaten 57
3.5.2 Untersuchungen an der Luft Wasser Grenzschicht 59
3.6 Schlußfolgerung 60
3.7 Literatur 61
4 Herstellung der Artificial Virus Like Particles (AVP) 65
4.1 Einführung 65
4.2 Bestandteile der Artificial Virus Like Particles 66
4.2.1 Die Plasmid DNA 66
4.2.2 Polyethylenimin (PEI) 67
4.2.3 Protaminsulfat 70
4.2.4 Artificial Viral Envelopeâ„¢ (AVE) 70
4.2.4.1 Material und Geräte 71
4.2.4.2 Synthese des DPPE Derivates (Anker Lipid) 72
4.2.4.3 Herstellung der Liposomen 73
4.2.4.4 Kopplung von Peptiden an Liposomen 74
4.2.4.4.1 Modifiziertes Peptid mit RGD Sequenz 76
4.2.4.4.2 Kopplung des Peptides an Lipidanker bei neutralem pH 77
4.2.4.4.3 Kopplung des Peptides an Lipidanker nach Bogdanov 79
4.3 Herstellung der AVP 80
4.4 Literatur 81
5 Biophysikalische Charakterisierung 84
5.1 Einleitung 84
5.2 Material und Methoden 84
5.2.1 Geräte 84
5.2.2 Chemikalien 85
5.2.3 Größenmessungen 85
5.2.4 Zetapotential 85
5.2.5 Elektronenmikroskopie 86
5.2.5.1 Transmissionselektronenmikroskopie 86
II
I
Inhaltsverzeichnis
5.2.5.2 Kryoelektronenmikroskopie 86
5.2.6 DNA Kondensation Messung mittels Dye Exclusion Technique 86
5.2.7 Bindungsstudien 87
5.2.7.1 Mikroskopische Auswertung 88
5.2.7.2 FACS 89
5.2.8 Stabilität 89
5.2.8.1 PCS 89
5.2.8.2 UV Spektroskopie 90
5.3 Resultate 90
5.3.1 Größenmessungen 90
5.3.1.1 Einfluß des Volumens bei der AVP 1 Herstellung 91
5.3.1.2 Stabilität der AVP 1 bei Raumtemperatur 91
5.3.1.3 Einfluß von Reihenfolge der Herstellung und der eingesetzten Scherkräfte... 92
5.3.1.4 Charakterisierung von AVP 2 93
5.3.2 Das Zetapotential 94
5.3.3 Elektronenmikroskopie 96
5.3.3.1 Transmissionselektronenmikroskopie 96
5.3.3.2 Kryo EM 97
5.3.4 DNA Kondensation Dye Exclusion Technique 99
5.3.5 Bindungsstudien 101
5.3.5.1 Mikroskopische Auswertung 101
5.3.5.2 FACS 103
5.3.6 Serumstabilität 103
5.3.6.1 Größenmessungen 103
5.3.6.2 UV Absorption 104
5.3.6.2.1 Einfluß des kondensierenden Agens auf die Stabilität 104
5.3.6.2.2 Einfluß der Lipidzusammensetzung auf die Serumstabilität 105
5.4 Diskussion 106
5.5 Schlußfolgerung 108
5.6 Literatur 109
6 Biologische Charakterisierung in vitro Charakterisierung 110
6.1 Einleitung 110
6.2 Material und Methoden 110
6.2.1 Geräte 110
6.2.2 Chemikalien 111
6.2.3 Zellkulturmedien und lösungen 111
6.2.4 Verwendete Zellen 111
6.2.5 Kulturbedingungen 112
6.2.6 Plasmidpräparation 113
6.2.7 Luziferaseassay 113
6.2.7.1 Material 113
6.2.7.2 Durchführung 114
6.2.8 Proteinbestimmung 114
6.2.9 „Green Fluorescent Protein GFP Expression 115
6.2.9.1 Mikroskopische Auswertung 115
6.2.9.2 FACS 115
6.2.10 Transfektion in Serum 115
6.3 Ergebnisse 116
III
Inhaltsverzeichnis
6.3.1 Einfluß der Anwendung von Liposomen auf die Transfektionseffizienz 116
6.3.2 Reihenfolge der AVP Präparation 117
6.3.3 Optimierung der eingesetzten Mengen 118
6.3.3.1 Verhältnis Lipid/DNA Kondensat 118
6.3.3.2 Konzentration AVP pro Zellkulturschale 118
6.3.4 Lipidzusammensetzung 119
6.3.5 Einfluß des Lipidankers 120
6.3.6 Einfluß des HA Fusionspeptids 120
6.3.7 Einfluß des Stickstoff/Phosphat Verhältnisses 121
6.3.8 Einfluß der eingesetzten PEI Verbindungen (Molekulargewicht) 121
6.3.9 Kombination mehrerer kationischer Verbindungen 122
6.3.10 Transfektion nach Seruminkubation 124
6.4 Diskussion 124
6.5 Schlußfolgerung 126
6.6 Literatur 127
7 In Vitro Charakterisierung II Optimierung 129
7.1 Einleitung 129
7.2 Material und Methoden 129
7.2.1 Verwendete Zellen 129
7.2.3 Verwendete Transfektionssysteme 130
7.2.3.1 Transfektion mit Superfectâ„¢ 130
7.2.3.2 Lipofektion mit Lipofectinâ„¢ und LipofectAMINâ„¢ 130
7.2.3.3 Transfektion mit Effecteneâ„¢ 131
7.2.3.4 Transfektion mit AVP 1 131
7.2.4 Auswertung der Transfektionseffizienz 132
7.2.5 Bestimmung der Toxizität 132
7.2.5.1 Untersuchung der Toxizität im Mikroskop 132
7.2.5.2 WST Toxizitätsassay 132
7.2.6 Doppelte Spezifität Einfluß des endothelspezifischen Promotors 133
7.3 Ergebnisse 134
7.3.1 Transfektionsvergleich mit käuflichen kationischen Systemen 134
7.3.2 Einfluß des gewebespezifischen Promotors 135
7.3.3 Transfektion in Abhängigkeit von der otvß3 Integrinexpression 137
7.4 Diskussion 140
7.5 Schlußfolgerung 140
7.6 Literatur 141
8 Zusammenfassung und Ausblick 142
8.1 Zusammenfassung 142
8.2 Ausblick 144
8.3 Literatur 145
9 Anhang 146
9.1 Lebenslauf 146
9.2 Veröffentlichungen 147
IV
|
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