Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms
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Jülich
Forschungszentrum
1994
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INHALT
S
VERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
2
MATERIAL
UND
METHODEN
8
2.1
ORGANISMEN
UND
PLASMIDE
.
8
2.2
NAEHRMEDIEN
UND
KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN
.
10
2.2.1
NAEHRMEDIEN
.
10
2.2.2
KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN
.
10
2.2.3
ISOLIERUNG
VON
FEEDBACK-RESISTENTEN
MUTANTEN
DER
THREONINDEHY
DRATASE
.
11
2.3
AMINOSAEUREBESTIMMUNG
.
13
2.4
HERSTELLUNG
VON
ROHEXTRAKTEN
.
13
2.5
PROTEINBESTIMMUNGEN
.
14
2.6
BESTIMMUNG
VON
ENZYMAKTIVITAETEN
.
14
2.7
GELFILTRATION
ZUR
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
.
16
2.8
ISOLIERUNG
DER
THREONINDEHYDRATASE
.
16
2.9
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
18
2.10
GEWINNUNG
POLYKLONALER
ANTISERA
.
18
2.11
SPEZIFISCHE
DETEKTION
VON
PROTEINEN
DURCH
WESTERN
BLOTTING
.
19
2.12
FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
.
20
2.13
ALLGEMEINE
GENETISCHE
TECHNIKEN
.
21
2.14
DNA:DNA-HYBRIDISIERUNG
.
22
2.15
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
24
2.15.1
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
UEBER
NAPYY-SAEULEN
.
24
2.15.2
HPLC
REINIGUNG
VON
FITC-MARKIERTEN
PRIMERN
.
25
2.16
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
26
2.17
ORTSSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
.
28
2.18
UNSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
.
31
2.19
DNA-SEQUENZIERUNG
.
32
2.20
COMPUTER-GESTUETZTE
SEQUENZANALYSE
.
34
3
ERGEBNISSE
37
3.1
CHARAKTERISIERUNG
DES
THREONINDEHYDRATASE
GENS
ILVA
UND
DESSEN
GEN
PRODUKTES
.
37
3.1.1
KINETISCHE
ANALYSE
DER
THREONINDEHYDRATASE
.
37
3.1.2
SEQUENZIERUNG
DES
GENS
.
41
3.1.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
EXPRESSION
DES
ILVA
GENS
.
45
3.1.4
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
LOKALISIERUNG
DES
ILVA
GENS
IM
GENOM
.
.
47
3.1.5
BESTIMMUNG
DES
NATIVEN
MOLEKULARGEWICHTES
DER
THREONINDEHY
DRATASE
.
49
3.1.6
HOMOLOGIEVERGLEICH
DER
PEPTIDSEQUENZ
.
49
3.1.7
ISOLIERUNG
DER
THREONINDEHYDRATASE
.
53
3.1.8
FLUORESZENZEMISSIONSSPEKTROSKOPIE
.
56
3.2
ERMITTLUNG
DER
SEKUNDAER
UND
DER
TERTIAERSTRUKTUR
DER
THREONINDEHY
DRATASE
.
57
3.2.1
SEKUNDAERSTRUKTUR
.
58
3.2.2
MODELLIERUNG
DER
TERTIAERSTRUKTUR
DER
THREONINDEHYDRATASE
.
61
3.3
HERSTELLUNG
DEREGULIERTER
THREONINDEHYDRATASE
MUTANTEN
.
68
3.3.1
HERSTELLUNG
VON
MUTANTEN
DURCH
ORTSSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
.
.
68
3.3.2
HERSTELLUNG
VON
MUTANTEN
DURCH
UNGERICHTETE
MUTAGENESE
.
71
3.3.3
GENETISCHE
UND
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
MUTIERTEN
THREONINDEHYDRATASEN
.
72
3.3.4
BESTIMMUNG
DER
KINETISCHEN
PARAMETER
DER
ENZYME
.
78
3.3.5
COMPUTERANALYSE
DER
AMINOSAEUREAUSTAUSCHE
.
84
3.4
VERSUCHE
ZUR
ISOLEUCINPRODUKTION
MIT
DEREGULIERTER
THREONINDEHYDRATASE
88
4
DISKUSSION
91
4.1
KINETISCHE
EIGENSCHAFTEN
DER
THREONINDEHYDRATASE
.
91
4.2
SEQUENZANALYSE
UND
HOMOLOGIEVERGLEICH
.
93
4.3
SEKUNDAER
UND
TERTIAERSTRUKTUR
DER
THREONINDEHYDRATASE
.
96
4.4
CHARAKTERISIERUNG
DER
MUTATIONEN
.
99
4.5
EINFLUSS
DEREGULIERTER
THREONINDEHYDRATASEN
AUF
DIE
ISOLEUCIN-PRODUKTION
102
5
ZUSAMMENFASSUNG
105
6
LITERATURVERZEICHNIS
106
7
ANHANG
124 |
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