Genetische Beweglichkeit und heterologe Expression von cyp153A1-Gen der P450-abhängigen Alkan-Monooxygenase aus Acinetobacter species EB104:
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2004
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I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
.
I
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
.IV
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
V
EINLEITUNG
.
1
1.1
HORIZONTALER
GENTRANSFER
BEI
BAKTERIEN
.
1
1.1.1
BEDEUTUNG
DES
HORIZONTALEN
GENTRANSFERES
.
1
1.1.2
BEWEGLICHE
BESTANDTEILE
DES
GENOMS
.
1
1.1.2.1
PLASMIDE
.
1
PLASMIDERHALTUNG
.
2
KONJUGATION
.
2
1.1.2.2
TRANSPONIERBARE
ELEMENTE
.
3
KLASSE
Z-TRANSPOSONS
.
4
KLASSE
ZZ-TRANSPOSONS
.4
ABLAUF
UND
REGULIERUNG
DER
TRANSPOSITION
.
5
KONJUGATIVE
TRANSPOSONS
(CTN)
.
6
1.2
CYTOCHROM
P450-MONOOXYGENASEN
.
6
1.2.1
FUNKTIONELLE
VIELFALT,
VERBREITUNG
UND
NOMENKLATUR
.
7
NOMENKLATUR
.
8
1.2.2
FUNKTIONALITAET
VON
P450
.
9
1.2.2.1
MOLEKULARE
EIGENSCHAFTEN
UND
REAKTIONSMECHANISMUS
.
9
SPEKTRALE
EIGENSCHAFTEN
.
9
REAKTIONSMECHANISMUS
.
9
STRUKTURMERKMALE
.
11
1.2.2.2
PARTNERPROTEINE
DES
ELEKTRONENTRANSPORTES
.
13
KLASSIFIZIERUNG
DA
-
P450-SYSTEME
.
13
WECHSELWIRKUNG
MIT
PARTNERPROTEINEN
.
14
WECHSELWIRKUNG
MIT
LIPIDEN
.
14
1.3
DIE
P450-ABHAENGIGE
ALKAN-MONOOXYGENASE
IN
ACINETOBACTER
SP.
EB104
.
15
1.3.1
DIE
GATTUNG
ACINETOBACTER
.
15
1.3.2
PLASMIDE
UND
TRANSPOSONS
DER
GATTUNG
ACINETOBACTER
.
15
1.3.3
ALKANSTOFFWECHSEL
IN
DER
NATUR
.
16
NICHTHAEM-ALKAN-HYDROXYLASEN
.
16
P450-ABHAENGIGE
ALKAN-HYDROXYLASEN
.
16
1.3.4
P450-ABHAENGIGE
ALKANHYDROXYLIERUNG
DURCH
CYP153A1
.
17
1.3.4.1
GENETISCHE
ORGANISATION
UND
MOLEKULARE
EIGENSCHAFTEN
VON
CYP153A1
.
17
1.3.4.2
FUNKTIONELLE
EIGENSCHAFTEN
.
18
1.3.4.3
WEITERE
VERTRETER
DER
CYP153-FAMILIE
.
18
1.4
ZIELSTELLUNG
.
20
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
.
21
2
CHARAKTERISIERUNG
DES
GENOMISCHEN
ZUSAMMENHANGES
UND
DER
BEWEGLICHKEIT
VON
CYPL53AL
.
21
2.1
ERGEBNIS
DER
SEQUENZIERUNG
.
21
2.2
EIGENSCHAFTEN
VON
PACL
.
22
2.3
ANALYSE
DER
PLASMIDSEQUENZ
VON
PAC450
.
24
2.3.1
ALLGEMEINE
EIGENSCHAFTEN
.
24
GC-GEHALT
.
26
2.3.2
EIGENSCHAFTEN
ZUR
ERHALTUNG
DES
PLASMIDES
.
27
2.3.2.1
REPLIZIERUNGSREGION
.
27
REPLIZIERUNGSPROTEIN
REPA
.
27
REPLIZIERUNGSURSPRUNG
ORIV
.
29
REPLIZIERUNGSTYP
.
30
N
2.3.2.2
PLASMIDSTABILITAET
UND
-AUFTEILUNG
WAEHREND
DE
-
ZELLTEILUNG
.
31
PLASMIDSTABILITAET
DURCH
TOXIN-ANTITOXIN-WIRKUNG
.
31
PLASMIDAUFTEILUNG.
32
2.3.3
GENETISCHE
BEWEGLICHKEIT
UND
TRANSPOSON
TNACSPL
.
34
2.3.3.1
MOBILISIERUNGSREGION
.
34
MOBILISIERUNGSPROTEINE
.
34
MUTMASSLICHER
ORIT
UND
TRA-FUNKTIONEN
.
36
2.3.3.2
STRUKTUR
DES
TRANSPOSONS
TNACSPL
.
37
ALLGEMEINE
EIGENSCHAFTEN
.
37
KLASSIFIZIERUNG
DES
IS^OSPL
.
37
DER
ZENTRALE
BEREICH
VON
TN4CSPL
.
42
ORF35
.
43
2.3.4
HERKUNFT
VON
PAC450
.
43
2.3.4.1
VERWANDTSCHAFT
DES
GRUNDPLASMIDES
MIT
BEKANNTEN
PLASMIDEN
.
43
2.3.4.2
VERWANDTSCHAFT
DES
ZENTRALEN
TRANSPOSONBEREICHES
MIT
BEKANNTEN
SEQUENZEN
.
43
2.3.4.3
HOMOLOGIE
VON
TNACSPL
UND
TN5047
.
45
2.3.4.4
WEITERE
HOMOLOGIEN
.
47
3
HETEROLOGE
EXPRESSION
VON
CYPL53AL
IN
.
COLI
.
48
3.1
VARIANTEN
VON
CYP153A1
.
48
3.1.1
VERKUERZUNG
DES
N-TERMINUS'
.
48
3.1.2
VERAENDERUNG
DER
FG-SCHLEIFE
.
50
3.1.3
FUSIONSPROTEIN
CYP153AL-NDHIS
.
51
KLONIERUNGSSTRATEGIE.
53
KLONIERUNG
.
53
3.2
VERAENDERUNG
DER
EXPRESSIONSBEDINGUNGEN
.
55
3.2.1
EXPORT
INS
PERIPLASMA
.
55
3.2.2
KOEXPRESSION
MIT
DEN
PARTNERPROTEINEN
.
55
3.2.3
EXPRESSION
NACH
HITZESCHOCK
UND
BEI
NIEDRIGER
TEMPERATUR
.
56
STANDARDBEDINGUNGEI
.
56
420
NM-MAXIMUM
.
56
KULTIVIERUNGSTEMPERATUR
.
57
CYP153ALHIS
.
58
3.3
WEITERFUEHRENDE
ERGEBNISSE
UND
UEBERBLICK
UEBER
DIE
EXPRESSIONSVERSUCHE
.
59
3.3.1
WEITERE
ERGEBNISSE
.
59
TRANSFORMIEREN
VON
E.
COLI
MIT
PAC450
.
59
CHAPERONUNTERSTUETZTE
EXPRESSION
.
59
INTAKTE
E.
COLI-ZSS\\EN
WERDEN
LANGSAM
REDUZIERT
.
60
ZELLAUFSCHLUSS
UND
REINIGUNG
DURCH
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
61
3.3.2
UEBERSICHT
EXPRESSIONSVERSUCHE
.
63
ZUSAMMENFASSUNG
.
65
MATERIAL
UND
METHODEN
.67
4
MATERIAL
.67
4.1
TECHNISCHE
AUSRUESTUNG
.
67
4.2
VEKTOREN
UND
BAKTERIENSTAEMME
.
68
4.2.1
VEKTOREN
.
68
KONSTRUIERTE
PLASMIDE
.69
4.2.2
BAKTERIENSTAEMME
.
69
4.3
ENZYME
UND
STANDARDS.
70
4.4
KOMMERZIELLE
ANWENDUNGSSYSTEME
.
72
4.5
CHEMIKALIEN
UND
KULTIVIERUNGSMEDIEN.
72
4.5.1
CHEMIKALIEN
.
72
4.5.2
BESONDERE
VERBRAUCHSMATERIALEN
.
72
4.5.3
KULTIVIERUNGSMEDIEN
.
73
4.6
OLIGONUCLEOTIDE
(PRIMER)
.
73
4.6.1
PRIMER
FUER
MUTAGENESE
UND
KLONIERUNG.
73
4.6.2
PRIMER
ZUR
ERMITTLUNG
DER
SEQUENZEN
DER
PLASMIDE
AUS
A.
SP.
EB104
.
74
M
5
METHODEN
.
75
5.1
LABORTECHNISCHE
SICHERHEIT
.
75
5.2
KULTIVIERUNGSMETHODEN
.
75
5.2.1
ACINETOBACTER
SP.
EB104
UND
ESCHERICHIA
COLI.
.
75
5.2.1.1
A.
SP.
EB104
.
75
5.2.1.2
E.
COLI
.
76
5.2.1.3
STAMMHALTUNG
DURCH
GLYCERINKULTUREN
.
76
5.3
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
76
5.3.1
DNA-MODIFIZIERUNGEN
.
76
5.3.1.1
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
76
PCR
ZUR
MUTAGENESE
DURCH
QUICK
CHANGE
.
78
5.3.1.2
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUCLEASEN
.
79
5.3.1.3
DEPHOSPHORYLIEREN
UND
LIGIEREN
VON
DNA
.
79
5.3.2
PLASMID-PRAEPARIERUNGSMETHODEN
.
80
5.3.2.1
MINI-PLASMIDPRAEPARIERUNG
YYALKALISCHE
LYSE
"
.
80
5.3.2.2
PLASMIDPRAEPARIERUNG
MITTELS
KOMMERZIELLER
SYSTEME
.
80
5.3.2.3
PLASMIDPRAEPARIERUNG
AUS
A.
SP.
EB104
.
81
5.3.3
TRENNUNG,
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
VON
NUCLEINSAEUREN
.
81
5.3.3.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
UND
ETHIDIUMBROMIDFAERBUNG
.
81
PRAEPARATIVE
AGAROSEGELE
.
82
5.3.3.2
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
.
82
5.3.3.3
REINIGUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
.
82
5.3.3.4
ALKOHOLFAELLUNG
.
83
5.3.4
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA-LOESUNGEN
.
83
5.3.5
TRANSFORMATION
MITTELS
ELEKTROSCHOCK
.
84
5.3.5.1
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
E.
CO/I-ZELLEN
.
84
5.3.5.2
TRANSFORMATION
.
84
5.3.6
UEBERPRUEFUNG
VON
DNA-SEQUENZEN
.
85
5.4
METHODEN
ZUR
PLASMIDSEQUENZIERUNG
DURCH
SCHROTSCHUSSBIBLIOTHEKEN
.
85
5.4.1
HERSTELLUNG
EINER
SCHROTSCHUSS-DNA-BIBLIOTHEK
.
85
5.4.1.1
PRAEPARIERUNG
DER
AUSGANGS-DNA
.
86
5.4.1.2
SCHEREN
VON
DNA
.
87
5.4.1.3
FRAKTIONIERUNG
GESCHERTER
DNA
.
87
5.4.1.4
VORBEREITUNG
DER
ENDEN
ZUM
LIGIEREN
.
88
5.4.2
SEQUENZIERUNG
UND
ZUSAMMENSETZEN
DER
EINZELSEQUENZEN
.
89
5.4.3
NACHARBEITEN
ZUR
ABSICHERUNG
EINZELNER
BEREICHE
.
89
5.5
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
.
90
5.5.1
PROBENNAHME
BEI
EXPRESSIONSVERSUCHEN
.
90
5.5.2
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PROTEINLOESUNGEN
.
90
5.5.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
P450
.
90
5.5.4
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(PAGE)
.
91
5.5.5
REINIGUNG
VON
P450
UEBER
EINEN
HISTAG
.
92
5.5.5.1
ZELLAUFSCHLUSS
.
92
5.5.5.2
REINIGUNG
AN
NINTA-MATRIX
.
92
5.6
BIOINFONNATISCHE
METHODEN
UND
METHODEN
ZUR
DNA-SEQUENZANALYSE
.
93
5.6.1
BIOINFONNATISCHE
ANWENDUNGEN
.
93
5.6.2
DNA-SEQUENZANALYSE
.
94
DNA-SEQUENZ
VON
PAC450
.
95
LITERATURVERZEICHNIS
.
99
SELBSTAENDIGKEITSERKLAERUNG
DANKSAGUNG |
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