Etablierung eines in-vitro-Modells zur gemischten Adipogenese und Osteogenese von humanen mesenchymalen Stammzellen und der Einfluss von 17-beta-Östradiol auf die gemischte Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen:
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 11
1.1. DIE MESENCHYMALE STAMMZELLE - EIN EINBLICK IN IHRE
ENTDECKUNGSGESCHICHTE 11
1.2. EIGENSCHAFTEN UND URSPRUNG DER MSCS 12
1.3. DIFFERENZIERUNGSVERHALTEN DER MSCS 13
1.6. OSTEOGENESE DER MSCS 16
1.7. ADIPOGENESE DER MSCS 19
1.7.1. PEROXISOME PROLIFERATOR ACTIVATED RECEPTOR (PPARY) 20
1.7.2. LIPOPROTEINLIPASE (LPL) 22
1.8. DIE TRANSDIFFERENZIERUNG VON HUMANEN MSCS 22
1.9. DIE ROLLE DER TRANSDIFFERENZIERUNG IM ZUSAMMENHANG MIT DER
OSTEOPOROSE 23
1.10. OESTROGEN 25
1.10.1. BIOCHEMIE DES SEXUALHORMONS 25
1.10.2. WIRKUNG VON OESTROGEN AUF DIE OSTEOGENESE/KNOCHENWACHSTUM 27
1.10.3. WIRKUNG VON OESTROGEN AUF DIE ADIPOGENESE 28
1.11. FRAGESTELLUNG 29
2. MATERIAL 30
2.1. VERBRAUCHSMATERIALIEN UND GERAETE 30
2.2. KITS 31
V I
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.3. PRIMER 32
2.4. CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 32
2.5. PUFFER UND LOESUNGEN 34
2.6. MEDIEN, MEDIENZUSAETZE UND SEREN 35
2.7. WACHSTUMSFAKTOREN 36
3. METHODEN 37
3.1. ZELLKULTUR DER HUMANEN MESENCHYMALEN STAMMZELLEN 37
3.1.1. ZELLISOLATION 37
3.1.4. AMPLIFIKATION 37
3.1.5. DIFFERENZIERUNG 38
3.1.6. ZELLERNTE UND LYSE DER ZELLEN 39
3.2. NASSCHEMISCHE ANALYSE DER ZELLEN 39
3.2.1. BESTIMMUNG DER GLYCEROL-3-PHOSPHAT DEHYDROGENASE AKTIVITAET 39
3.2.2. BESTIMMUNG DER AKTIVITAET DER ALKALISCHEN PHOSPHATASE 41
3.2.3. BESTIMMUNG DER DNA KONZENTRATION 41
3.2.3. CALCIUM-BESTIMMUNG MITTELS ALIZARIN RED S FAERBUNG 42
3.3. HISTOLOGIE 42
3.3.1. ALIZARIN RED S FAERBUNG 42
3.3.2. OIL RED O FAERBUNG 43
3.4. MOLEKULARBIOLOGISCHE ANALYSE DER ZELLEN 43
3.4.1. ARBEITEN MIT RNA 43
VII
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.1.1. ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS HMSC 43
3.4.1.2. DNASE VERDAU 44
3.4.1.3. BESTIMMUNG DER RNA-KONZENTRATION 44
3.4.1.4. GELELEKTROPHORETISCHE OBERPRUEFUNG DER REINHEIT DER RNA 45
3.4.1.5. REVERSE TRANSKRIPTION 46
3.4.2. SEMI-QUANTITATIVE REAL-TIME PCR 47
3.6. STATISTIK 48
4. ERGEBNISSE 49
4.1. ETABLIERUNG DER METHODEN 49
4.1.1. ZELLLYSEVERFAHREN UND GPDH-ASSAY 49
4.1.1.1. OBG-PUFFER. 49
4.1.1.2. Z2-PUFFER 50
4.1.2. MODIFIKATION DER AP-MESSUNG 50
4.1.3. CALCIUM-QUANTIFIZIERUNG MITTELS ALIZARIN RED FAERBUNG 50
4.2. ETABLIERUNG EINES IN-VITRO MODELLS ZUR GEMISCHTEN ADIPO- UND
OSTEOGENESE 53
4.2.1 ERGEBNISSE ADIPOGENESE 54
4.2.1.1. EINFLUSS VON INSULIN 54
4.2.1.1. EINFLUSS VON IBMX 55
4.2.2. ERGEBNISSE OSTEOGENESE 57
4.2.3. ERGEBNISSE GEMISCHTE ZELLKULTUR 58
4.2.4. ZUSAMMENSETZUNG DER MEDIEN DES IN-VITRO-MODELLS FUER GEMISCHTE
ADIPO-UND
OSTEOGENESE 60
VIII
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
4.3. EINFLUSS VON 17-SS-OESTRADIOL AUF DIE ADIPOGENE UND OSTEOGENE
DIFFERENZIERUNG VON HMSCS 61
4.3.1 EINFLUSS VON OESTROGEN AUF DIE ADIPOGENESE 62
4.3.1.1. UNTER BASALEN BEDINGUNGEN 62
4.3.1.2. UNTER ADIPOGENEN BEDINGUNGEN 65
4.3.1.3. UNTER GEMISCHTEN BEDINGUNGEN 69
4.3.2. EINFLUSS VON OESTROGEN AUF DIE OSTEOGENESE 74
4.3.2.1. UNTER BASALEN BEDINGUNGEN 74
4.3.2.2. UNTER OSTEOGENEN BEDINGUNGEN 76
4.3.2.3. UNTER GEMISCHTEN BEDINGUNGEN 81
5. DISKUSSION 86
5.1. ETABLIERUNG EINES IN-VITRO MODELLS ZUR GEMISCHTEN ADIPO- UND
OSTEOGENESE 86
5.2. EINFLUSS VON 17-SS-OESTRADIOL AUF DIE ADIPOGENE UND OSTEOGENE
DIFFERENZIERUNG VON HUMANEN MESENCHYMALEN STAMMZELLEN 86
5.2.1. EINFLUSS VON OESTROGEN AUF DIE ADIPOGENESE 86
5.2.1.1. UNTER BASALEN BEDINGUNGEN 86
5.2.1.2. UNTER ADIPOGENEN BEDINGUNGEN 86
5.2.1.3. UNTER GEMISCHTEN BEDINGUNGEN 87
5.2.2 EINFLUSS AUF DIE OSTEOGENESE 88
5.2.2.1. UNTER BASALEN BEDINGUNGEN 88
5.2.2.2. UNTER OSTEOGENEN BEDINGUNGEN 89
5.2.2.3. UNTER GEMISCHTEN BEDINGUNGEN 90
IX
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS
6. ZUSAMMENFASSUNG 92
7. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 94
8. TABELLENVERZEICHNIS 98
9. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 99
10. LITERATURVERZEICHNIS 103
11. DANKSAGUNG 114
12. LEBENSLAUF 115
13. ERKLAERUNG ZUR DISSERTATION 119
X
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