Photoaffinitätsmarkierung der humanen lysosomalen Beta-Hexosaminidase B:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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1996
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| Beschreibung: | Bonn, Univ., Diss., 1996 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
1. ZUSAMMENFASSUNG.3
2. EINLEITUNG.5
2.1 HISTORISCHER UEBERBLICK.5
2.2 GANGLIOSIDE.6
2.3 DIE SS-HEXOSAMINIDASEN.8
2.3.1 PROTEINSTRUKTUR, BIOSYNTHESE UND POSTTRANSLATIONALE
MODIFIKATIONEN.8
2.3.2 SUBSTRATSPEZIFITAETEN.12
2.3.3 GENSTRUKTUR.*.13
2.4 VARIANTEN DER GM2-GANGLIOSIDOSEN.13
2.5 ZIELSETZUNG.14
2.5.1 DIE PHOTOAFFINITAETSMARKIERUNG.15
2.5.2 CHIMAERE HEXOSAMINIDASEN.16
3. ERGEBNISSE.17
3.1 REINIGUNG DER HUMANEN LYSOSOMALEN SS-HEXOSAMINIDASE B.17
3.2 POTENTIELLE PHOTOAFFINITAETSLIGANDEN.20
3.2.1 SYNTHESE.20
3.2.2 BESTIMMUNG DER HEMMKONSTANTEN.23
3.2.3 IRREVERSIBLE HEMMUNG DER HEX B.25
3.3 PHOTOAFFINITAETSMARKIERUNG DER HUMANEN LYSOSOMALEN HEX B.26
3.3.1 DAS BELICHTUNGSEXPERIMENT.26
3.3.2 GELFILTRATION UNTER DENATURIERENDEN BEDINGUNGEN.26
3.3.3 TRENNUNG DER SS
A- UND SSB-POLYPEPTIDE.27
3.3.4 DAS 8-LAKTON REDUZIERT SPEZIFISCH DIE MARKIERUNG DES SS
A-POLYPEPTIDS.29
3.3.5 TRYPTISCHE FRAGMENTIERUNG DES SS
A- UND SSB-POLYPEPTIDS.30
3.3.6 EDMAN-ABBAU DES PROMINENT MARKIERTEN PEPTIDS.34
' 3.3.7 RECHROMATOGRAPHIE DES MARKIERTEN PEPTIDS.35
3.3.8 MALDI-TOF-MS-ANALYSE DER IN PEAK 1, 2 UND 3 ENTHALTENEN PEPTIDE.37
3.3.9 IDENTIFIZIERUNG DER DURCH [
3H]-L-ATB-GALNAC MARKIERTEN AMINOSAEURE.39
3.3.10 HOMOLOGE REGIONEN DER HEXOSAMINIDASEN IN DER NAEHE VON GLU-355 .41
3.4 CHIMAERE HEXOSAMINIDASEN.42
3.4.1 GM2-HYDROLYSE-AKTIVITAET CHIMAERER HEXOSAMINIDASEN.45
3.4.2 K
M- UND VMAX-WERTE REKOMBINANTER HEX B UND HEX S.46
4. DISKUSSION.49
4.1 IDENTIFIZIERUNG VON GLU-355 AN DER SUBSTRATBINDUNGSSTELLE VON HEX
B.49
4.2 CHIMAERE HEXOSAMINIDASEN.53
5. MATERIAL UND METHODEN.
55
5.1 MATERIAL.^
5.1.1 GERAETE.^
5.1.2 CHROMATOGRAPHIE-SAEULEN.55
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/947993754
2
INHALTSVERZEICHNIS
5.1.3 CHEMIKALIEN.
5.1.4 PROTEINE UND GEWEBE.
5.2 CHEMISCHE SYNTHESEN.
5.2.1 KRISTALLISATION VON 2-ACETAMIDO-L,2,4-TRIDESOXY-D-GALAKTITOL UND
ROENTGENSTRUKTURANALYSE.
5.2.2 SYNTHESE VON 3-(2,2-DIMETHOXYETHYL)-3-METHYL-DIAZIRIDIN.
5.2.3 SYNTHESE VON 3-(2,2-DIMETHOXYETHYL)-3-METHYL-DIAZIRIN.
5.2.4 SYNTHESE VON 3-METHYL-3H-DIAZIRIN-3YL-ACETALDEHYD.
5.2.5 SYNTHESE VON
2-ACETAMIDO-L,4-IMINO-N-[2-(3-METHYL-3H-DIAZIRIN-3YL)- ETHYL]-
1,2,4-TRIDESOXY-D-GALAKTITOL.
5.2.6 SYNTHESE VON 2-ACETAMIDO-L,4-IMONIUM-N-METHYL-N-[2-(3-METHYL-3H-
DIAZIRIN-3YL)-ETHYL]-L ,2,4-TRIDESOXY-D-GALAKTITOL IODID.
5.3 PROTEINCHEMISCHE METHODEN.
5.3.1 AKTIVITAETSMESSUNGEN DER LYSOSOMALEN SS-HEXOSAMINIDASEN A, B UND S.
5.3.2 GM2-HYDROLYSE-AKTIVITAET CHIMAERER HEXOSAMINIDASEN.
5.3.3 KI-WERT BESTIMMUNGEN.
5.3.4 K
M- UND
VMAX-WERT
BESTIMMUNGEN.
5.3.5 PROTEIN-BESTIMMUNG NACH BRADFORD.
5.3.6 SDS-PAGE, COOMASSIE-BLUE FAERBUNG UND FLUOROGRAPHIE.
5 .4 REINIGUNG DER LYSOSOMALEN SS-HEXOSAMINIDASEN.
5.4.1 HOMOGENISIERUNG UND FRAKTIONIERTE AMMONIUMSULFATFAELLUNG.
5.4.2 CONCANAVALIN A-SEPHAROSE.
5.4.3 ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE.
5.4.4 KATIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE.
5.4.5 GELFILTRATION.
5.5 PHOTOAFFINITAETSMARKIERUNG DER LYSOSOMALEN SS-HEXOSAMINIDASE B.
5.5.1 DAS BELICHTUNSEXPERIMENT UND BESTIMMUNG DER HEX B-INAKTIVIERUNG.
5.5.2 DAS BELICHTUNSEXPERIMENT IN GEGENWART DES 5-LAKTONS.
5.5.3 GELFILTRATION UNTER DENATURIERENDEN BEDINGUNGEN.
5.5.4 TRENNUNG DES SS
A- UND SSB-POLYPEPTIDS UEBER REVERSE-PHASE HPLC.
5.5.5 TRYPTISCHER VERDAU DES SS
A- UND SSB-POLYPEPTIDS.
5.5.6 ISOLIERUNG DER DURCH [
3H]-1 - ATB-GALNAC MARKIERTEN PEPTIDE.
5.5.7 RECHROMATOGRAPHIE DER HAUPTSAECHLICH MARKIERTEN PEPTID-FRAKTION.
5.5.8 MALDI-TOF-MS.
5.5.9 BASENBEHANDLUNG DES PROMINENT MARKIERTEN PEPTIDS.
5.5.10 PEPTID-SEQUENZIERUNG.
5.5.11 AMINOSAEURESEQUENZ-VERGLEICH.
6. LITERATUR.
7. LEBENSLAUF.
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