Funktion CBX1-abhängiger Regulation von DNA-Schädigungssignalwegen in der Zellalterung und nach akuter DNA-Schädigung:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2013
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|---|---|
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INHALT
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS ; VII
1 EINLEITUNG -1 -
1.1 HETEROCHROMATIN UND EPIGENETISCHE MECHANISMEN - 2 -
1.2 T ELOMERE - 5 -
1.3 TELOMERASE - 7 -
1.4 DNA-SCHAEDIGUNGSSIGNALKASKADE - 8 -
1.5 TELOMERHYPOTHESE DER ZELLALTERUNG UND IMMORTALISATION -14 -
1.6 CBX1
- EIN HOCHKONSERVIERTES ADAPTERMOLEKUEL MIT EPIGENETISCHEN EIGENSCHAFTEN
-17 -
1.7 ZIELE DER ARBEIT - 25 -
2 MATERIAL UND
METHODEN - 26 -
2.1 ARBEITEN MIT BAKTERIEN - 26 -
2.1.1 KULTIVIERUNG VON BAKTERIEN UND DEREN LAGERUNG - 26 -
2.1.2 HERSTELLUNG CHEMISCH KOMPETENTER BAKTERIENZELLEN - 26 -
2.1.3 TRANSFORMATION CHEMISCH KOMPETENTER E. COLI-ZELLEN - 27 -
2.1.4 ALKALISCHE MINIPRAEPARATION VON
PLASMID-DNA AUS E. COLI - 27
-
2.2 KULTIVIERUNG VON SAEUGERZELLEN - 28 -
2.2.1 PASSAGIERUNG -28-
2.2.2 EINFRIEREN VON ZELLEN - 29 -
2.2.3 AUFTAUEN VON ZELLEN - 29 -
2.2.4 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL FUER WACHSTUMSKURVEN - 29 -
2.2.5 TRANSFEKTION MITTELS CALCIUM-PHOSPHAT-PRAEZIPITATION - 29 -
2.2.6 GENERIERUNG STABILER EUKARYOTISCHER ZELLLINIEN MITTELS
VIRUSINFEKTION - 30 -
2.2.7 FACS-APOPTOSEANALYSE MITTELS ANNEXIN - 30 -
2.2.8 FACS-ZELLZYKLUSANALYSE MITTELS PROPIDIUMIODID - 31 -
2.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN - 31 -
2.3.1 GENOTYPISIERUNG MITTELS POLYMERASE-KETTENREAKTION - 31 -
2.3.2 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE - 32 -
2.3.3 VERDAU VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN - 32 -
2.3.4 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN - 33 -
III
HTTP://D-NB.INFO/1043593950
INHALT
2.3.5 AUFREINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN UND PLASMIDEN - 34 -
2.3.6 RNA-ISOLIERUNG - 34 -
2.3.7 REVERSE T RANSKRIPTION - 34 -
2.3.8 REAL TIME QUANTITATIVE PCR - 35 -
2.3.9 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS MAUSSCHWANZBIOPSIEN - 36 -
2.3.10 PHENOL/CHLOROFORM-AUFREINIGUNG VON GENOMISCHER DNA - 36 -
2.3.11 SOUTHERN BLOT - 36 -
2.3.12 MARKIERUNG DER SONDEN UND HYBRIDISIERUNG - 37 -
2.4 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN - 38 -
2.4.1 ISOLIERUNG VON GESAMTPROTEIN - 38
-
2.4.2 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD - 39 -
2.4.3 SDS-PAGE - 39 -
2.4.4 WESTERN BLOT - 40 -
2.5 IMMUNHISTOCHEMISCHE METHODEN - 41
-
2.5.1 IMMUNFLUORESZENZ-FAERBUNG - 41 -
2.5.2 CBX1-FAERBUNG - 41
-
2.5.3 F H2AX-FAERBUNG - 42 -
2.5.4 SENESZENZ-FAERBUNG - 43 -
2.5.5 Q-FISH -43-
2.6 BAKTERIENSTAEMME UND ZELLLINIEN - 45 -
2.7 PLASMIDE -46-
2.8 ANTIKOERPER - 46 -
2.9 OLIGONUKLEOTIDE - 47
-
2.10 STATISTIK - 48 -
3 ERGEBNISSE * 49 -
3.1 ANALYSE DER ROLLE VON CBX1 IM RAHMEN DER INDUKTION VON
SENESZENZ IN ANTWORT AUF TELOMERDYSFUNKTION - 49 -
3.1.1 DER ALTERUNGSPROZESS BEWIRKT EINE REDUKTION DES CBX1-LEVELS SOWIE
EINE VERSTAERKTE PHOSPHORYLIERUNG VON CBX1 IN HUMANEN FIBROBLASTEN - 50 -
IV
INHALT
3.1.2 DER ALTERUNGSPROZESS INDUZIERT EINE REDUKTION DES CBX1-LEVELS
IN MURINEM DARM- UND LEBERGEWEBE - 52 -
3.1.3 DESIGN DER CBX1 SHRNA-KONSTRUKTE UND DEREN KLONIERUNG - 53 -
3.1.4 ANALYSE DER CBXF-KNOCKDOWN-EFFIZIENZ AUF RNA- UND PROTEINEBENE -
55 -
3.1.5 DER CBX1-KNOCKDOWN FUEHRT ZU EINER VORZEITIGEN INDUKTION VON
SENESZENZ - 57 -
3.1.6 EINE REDUZIERTE CBX1-EXPRESSION BEWIRKT KEINEN UNTERSCHIED IN
APOPTOSE - 61
-
3.1.7 KNOCKDOWN VON CBX1 FUEHRT ZU KEINER VERKUERZUNG DER TELOMERE - 62 -
3.1.8 KNOCKDOWN VON CBX1 BEWIRKT EINE VERSTAERKTE AKTIVIERUNG
DER DNA-SCHAEDIGUNGSANTWORT IN PRAESENESZENTEN HUMANEN FIBROBLASTEN - 63 -
3.1.9 VERMINDERTE CBX1
-EXPRESSION INDUZIERT EINE SIGNIFIKANT ERHOEHTE
TIF-ANZAHL IN PRAESENESZENTEN HUMANEN FIBROBLASTEN - 70
-
3.1.10 VORZEITIGE INDUKTION VON SENESZENZ MITTELS CBX1-KNOCKDOWN WIRD IN
IMMORTALISIERTEN HUMANEN FIBROBLASTEN AUFGEHOBEN - 72
-
3.1.11 VERMINDERTE CBX1-EXPRESSION KORRELIERT MIT EINER REDUZIERTEN
KOLONIEFORMATION IN HUMANEN HTERT/H-RAS
V12
FIBROBLASTEN - 74 -
3.2 ANALYSE DER ROLLE VON CBX1 IN ANTWORT AUF AKUTE DNA-SCHAEDIGUNG - 76
-
3.2.1 DER CBX1-KNOCKDOWN FUEHRT IN JUNGEN HUMANEN FIBROBLASTEN ZU EINER
ERHOEHTEN STRAHLUNGSSENSITIVITAET MIT EINGESCHRAENKTER
PROLIFERATIONSKAPAZITAET - 76 -
3.2.2 JUNGE HUMANE
FIBROBLASTEN MIT VERMINDERTER CBX1-EXPRESSION INDIZIEREN
EINE VERSTAERKTE DNA-SCHAEDIGUNGSANTWORT MIT ERHOEHTER TIF-ANZAHL IM
ZEITLICHEN VERLAUF NACH Y-BESTRAHLUNG - 81 -
3.2.3 Y-BESTRAHLUNG BEWIRKT EINE REDUKTION
DES CBX1-LEVELS
UND VERSTAERKTE PHOSPHORYLIERUNG VON CBX1 IN JUNGEN HUMANEN FIBROBLASTEN
- 86 -
3.2.4 IMMORTALISIERTE HUMANE FIBROBLASTEN MIT VERMINDERTER
CBX1-EXPRESSION
ZEIGEN KEINEN UNTERSCHIED IN PROLIFERATION UND DDR NACH Y-BESTRAHLUNG -
89 -
3.3 GENERIERUNG EINES KONDITIONEILEN CBX1-KNOCKOUT-MAUSMODELLS - 93 -
3.3.1 DESIGN DES COEXF-ZIELVEKTORS - KLONIERUNGSSTRATEGIE - 94 -
3.3.2 SOUTHERN BLOT- UND GENOTYPISIERUNGSSTRATEGIE ZUM NACHWEIS
DES MODIFIZIERTEN CBX
7-GENLOKUS - 95 -
V
INHALT
3.3.3 VERIFIZIERUNG DER HOMOLOGEN REKOMBINATION IN MURINEN EMBRYONALEN
STAMMZELLEN UND DER KEIMBAHNTRANSMISSION - 97 -
3.3.4 GENOTYPISIERUNG DER KONDITIONEILEN CBX1-KNOCKOUT-MAEUSE -98-
3.3.5 DELETION VON CBX1 IM PROLIFERATIVEN EPITHELIALEN DARMGEWEBE - 98 -
3.3.6 CBX1-KNOCKOUT BEWIRKT EINE VERSTAERKTE DNA-SCHAEDIGUNGSANTWORT
NACH Y-BESTRAHLUNG -101 -
4 DISKUSSION -103 -
4.1 FUNKTIONELLE ANALYSE VON CBX1 UND DESSEN EINFLUSS AUF DIE
ZELLALTERUNG -103 -
4.2 FUNKTIONELLE ANALYSE VON CBX1 IN ANTWORT AUF AKUTE DNA-SCHAEDIGUNG
-107 -
4.3 GENERIERUNG EINES KONDITIONELLEN CBX1-KNOCKOUT-MAUSMODELLS -109 -
5 ZUSAMMENFASSUNG -112 -
ABSTRACT -113 -
6 LITERATURVERZEICHNIS -114-
ANHANG -132 -
A EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG -132 -
B CURRICULUM VITAE -133 -
C DANKSAGUNG -134 -
D ABBILDUNGSVERZEICHNIS -135 -
E TABELLENVERZEICHNIS -138 -
T
VI
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