Untersuchungen zur pathophysiologischen Funktion der G-Protein-vermittelten Transaktivierung des epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptors in Tumorzellen:
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
1
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 TYROSINPHOSPHORYLIERUNG UND PROTEIN-TYROSINKINASEN 2
1.1.1 REZEPTORTYROSINKINASEN (RTKN) 3
1.1.2 DIE EGFR FAMILIE UND REZEPTORAKTIVIERUNG 4
1.1.3 REZEPTORAKTIVIERUNG DURCH WACHSTUMSFAKTOREN DER EGF FAMILIE 6
1.1.4 ZYTOPLASMATISCHE TYROSINKINASEN 8
1.1.5 RTK DOWNSTREAM SIGNALING UND INTERAKTIONSDOMAENEN VON PROTEINEN 9
1.2 G-PROTEIN-GEKOPPELTE REZEPTOREN (GPCRN) 10
1.2.1 HETEROTRIMERE G-PROTEINE 11
1.2.2 GPCR SIGNALTRANSDUKTION IM ZENTRALEN NERVENSYSTEM 12
1.2.2.1 BOMBESIN-AEHNLICHE PEPTIDE 13
1.2.2.2 ENDOTHELIN 13
1.2.2.3 NEUROTENSIN 13
1.3 MITOGENE GPCR-VERMITTELTE SIGNALTRANSDUKTION UND DER SIGNALWEG DER
MITOGEN-AKTIVIERTENPROTEINKINASEN (MAPK) 14
1.4 DIE EGFR TRANSAKTIVIERUNG 17
1.4.1 HISTORISCHE UND MECHANISTISCHE BESCHREIBUNG DER EGFR
TRANSAKTIVIERUNG 17
1.4.2 ZELLTYPSPEZIFISCHE ELEMENTE DER G-PROTEIN-INDUZIERTEN EGFR
TRANSAKTIVIERUNG UND VERMITTLUNG VON GPCR-INDUZIERTEN ZELLULAEREN
EREIGNISSEN 19
1.4.3 ADAM METALLOPROTEASEN ALS SCHLUESSELELEMENTE DER GPCR-INDUZIERTEN
EGFR TRANSAKTIVIERUNG 24
1.5 KREBSENTSTEHUNG UND MOLEKULARE ONKOLOGIE 26
1.6 ZIELSETZUNG 29
2. MATERIAL UND METHODEN 3 0
2.1 BEZUGSQUELLENNACHWEIS 30
2.1.1 CHEMIKALIEN 30
2.1.2 ENZYME 31
2.1.3 RADIOCHEMIKALIEN 31
2.1.4 LIGANDEN UND WACHSTUMSFAKTOREN 31
2.1.5 KITS UND SONSTIGE MATERIALIEN 32
2.2 MEDIEN UND PUFFER 32
2.2.1 MEDIEN FUER E.COLI BAKTERIEN 32
2.2.2 ZELLKULTURMEDIEN 32
2.2.3 PUFFER UND STAMMLOESUNGEN 33
2.3 ZELLINIEN, BAKTERIENSTAEMME UND ANTIKOERPER 34
2.3.1 ZELLINIEN 34
2.3.2 BAKTERIENSTAEMME 35
2.3.3 ANTIKOERPER 35
2.4 PLASMIDE 37
2.4.1 AUSGANGSVEKTOREN 37
2.4.2 IM RAHMEN DIESER ARBEIT VERWENDETE VEKTOREN 37
2.4.3 WICHTIGE OLIGONUKLEOTIDE 37
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IMAGE 2
11
INHALTSVERZEICHNIS
2.5 ALLGEMEINE MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 38
2.5.1 PLASMIDPRAEPARATION FUER ANALYTISCHE ZWECKE 38
2.5.2 PLASMIDPRAEPARATION FUER PRAEPARATIVE ZWECKE 38
2.5.3 ENZYMATISCHE BEHANDLUNG VON DNA 38
2.5.3.1 VERDAU VON DNA-FRAGMENTEN MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 3 8
2.5.3.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON 5 -ENDEN LINEARISIERTER VEKTOREN 38
2.5.3.3 VERKNUEPFUNG VON DNA-FRAGMENTEN MIT T4-DNA-LIGASE 38
2.5.4 GELELEKTROPHORESE VON DNA 39
2.5.5 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 39
2.5.6 TRANSFER VON DNA IN E.COLI BAKTERIEN 39
2.5.6.1 HERSTELLUNG KOMPETENTER E.COLI BAKTERIEN 39
2.5.6.2 TRANSFORMATION VON KOMPETENTEN E.COLI BAKTERIEN 39
2.5.6.3 DAUERKULTUREN VON TRANSFORMIERTEN E.COLI BAKTERIEN 39
2.5.7 AMPLIFIKATION VON DNA- UND CDNA FRAGMENTEN MIT PCR (POLYMERASE
KETTENREAKTION) 40 2.5.8 SEQUENZIERUNG 40
2.5.9 SEQUENZVERGLEICH 41
2.5.10 CDNA MAKROARRAYS 41
2.6 METHODEN ZUR ARBEIT MIT EUKARYONTISCHEN ZELLEN 42
2.6.1 ALLGEMEINE ZELLKULTURTECHNIKEN 42
2.6.2 MYKOPLASMENTEST 42
2.6.3 LIPOFECTAMINE -LIPOFECTINE- UND LIPOFECTAMINE 2000
TRANS-FEKTION 42
2.6.4 BESTIMMUNG DER TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ 43
2.7 PROTEINANALYTISCHE METHODEN 43
2.7.1 STIMMULATION UND TRITON X-100 LYSE VON ZELLEN 43
2.7.2 PROTEINBESTIMMUNG 43
2.7.3 IMMUNPRAEZIPITATION VON PROTEINEN 43
2.7.4 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 44
2.7.5 TRANSFER VON PROTEINEN AUF EINE NITROZELLULOSEMEMBRAN 44
2.7.6 IMMUNDETEKTION VON PROTEINEN (IMMUNOBLOTANALYSE) 45
2.8 ZELLBIOCHEMISCHE UND -BIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 45
2.8.1 UNTERSUCHUNG DER TYROSINPHOSPHORYLIERUNG VERSCHIEDENER PROTEINE 45
2.8.2 QUANTIFIZIERUNG VON IMMUNOBLOTS MIT EINER CCD-KAMERA 46
2.8.3 IN VITRO KINASE-ASSAY ZUR BESTIMMUNG DER KATALYTISCHEN AKTIVITAET
DER MAP KINASE (ERK2) 46 2.8.4 WOUND HEALING TEST 46
2.8.5 INVASIONS ASSAY 47
2.9 STATISTISCHE ANALYSE 47
3. E R G E B N I S S E 4 8
3.1 TRANSAKTIVIERUNG DES EPIDERMALEN WACHSTUMSFAKTORREZEPTORS (EGFR)
DURCH NEUROPEPTIDE: DIE NEURO-PSYCHO-ONKO -VERBINDUNG 48
3.1.1 LPA, ET-1 UND BOMBESIN-AEHNLICHE LIGANDEN INDUZIEREN EGFR
TRANSAKTIVIERUNG IN VERSCHIEDENEN PROSTATAKARZINOMZELLEN 49
3.1.2 GASTRIN RELEASING PEPTIDE TRANSAKTIVIERT DEN EGFR IN FTC-133
SCHILDDRUESENKARZINOMZELLEN 52 3.1.3 WEITERE NEUROPEPTIDE ALS AKTIVATOREN
DES EGFR SIGNALWEGES IN PROSTATAKREBSZELLEN 55 3.1.4 ANALYSE WEITERER
TUMORTYPEN: CHARAKTERISIERUNG VON MAGEN- UND PANKREASTUMORZELLEN IN
HINSICHT AUF GASTRIN- UND LPA ANTWORTEN 58
3.1.5 SCREEN WEITERER TUMORZELLEN 59
3.2 METALLOPROTEASE-ABHAENGIGE TRANSAKTIVIERUNG DES EGFRS NACH
STIMULATION VON GPCRS IN KREBSZELLEN 61
3.2.1 VERRINGERUNG DER BASALEN EGFR TYROSINPHOSPHORYLIERUNG SOWIE DER
PHOSPHOIYLIERUNGSLEVEL DER SIGNALMOLEKUELE SHC UND ERK1/2 IN TUMORZELLEN
DURCH DIE METALLOPROTEASE-INHIBITOREN BATIMASTAT UND MARIMASTAT 62
3.2.2 INHIBITION DER EGFR TRANSAKTIVIERUNG DURCH T1MP-3 66
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
III
3.3 TEST DES PEPTID-INHIBITORS ACETYL GASTRIN RELEASING PEPTIDE
(ACGRP) 67
3.4 DIE GPCR-VERMITTELTE EGFR TRANSAKTIVIERUNG UND IHRE
DOWNSTREAM -SIGNALE IN ABHAENGIGKEIT VON HB-EGF- ODER AMPHIREGULIN 69
3.5 ZUSAMMENFASSUNG DER AUF EGFR TRANSAKTIVIERUNG POSITIV GETESTETEN
TUMORZELLINIEN SOWIE DIE INHIBITOR-SENSITIVITAET DER ZELLULAEREN ANTWORTEN
NACH GPCR-STIMULATION DER ZELLEN 74
3.6 CDNA MAKROARRAYS VON PROSTATAKREBSZELLINIEN ZUR EXPRESSIONSKONTROLLE
VERSCHIEDENER SIGNALTRANSDUKTIONSMOLEKFILE 75
3.7 EGFR-VERMITTELTE PHOSPHORYLIERUNG ZELLULAERER PROTEINE NACH
GPCR-STIMULATION 80 3.7.1 SHC TYROSINPHOSPHORYLIERUNG INDUZIERT VON G Q
- UND G;-GEKOPPELTEN REZEPTOREN IN ABHAENGIGKEIT DES EGFRS UND
METALLOPROTEASEN 80
3.7.2 SOWOHL EGFR- ALS AUCH METALLOPROTEASEINHIBITION BEEINTRAECHTIGEN
DIE MAPK AKTIVIERUNG DURCH GPCR IN PROSTATAKARZINOMZELLEN 84
3.7.3 METALLOPROTEASEABHAENGIGKEIT DER GPCR-INDUZIERTEN
ERKL/2-STIMULATION IN FTC-133 SCHILDDRUESENKARZINOMZELLEN 85
3.7.4 ADDITIVER EFFEKT VON LPA UND GRP AUF DIE MAP KINASE AKTIVIERUNG IN
PC3 PROSTATAKARZINOMZELLEN 87 3.7.5 KEINE PHOSPHORYLIERUNG DER ERK5 NACH
GPCR-AKTIVIERUNG IN PC3 ZELLEN 88
3.7.6 KEINE AKTIVIERUNG VON FOCAL ADHESION KINASE (FAK) IN PC3 UND TSU
ZELLEN NACH GPCR-STIMULATION 88
3.8 SPIELT DIE PROTEIN KINASE C (PKC) IM SIGNALWEG DER EGFR
TRANSAKTIVIERUNG IN DEN AUSGEWAEHLTEN KREBSZELLINIEN EINE ROLLE? 89
3.8.1 IN PC3 UND TSU PROSTATAKARZINOMZELLEN IST PKC NICHT IN DIE
G-PROTEIN-VERMITTELTE TRANSAKTIVIERUNG DES EGFRS INVOLVIERT 90
3.8.2 AUCH IN FTC-133 ZELLEN VERMITTELT PKC KEINE EGFR TRANSAKTIVIERUNG
93
3.8.3 TPA VERRINGERT DEN BASALEN PHOSPHOTHYROSINGEHALT DES EGFRS IN
BT-20 UND MDA-MB 468 MAMMAKARZINOMZELLEN 94
3.8.4 ROLLE DER PKC BEI DER GPCR-STIMULIERTEN MAPK- UND
AKT-SIGNALAKTIVIERUNG IN PC3 ZELLEN 96
3.9 ERMITTLUNG DER PATHOPHYSIOLOGISCHEN ROLLE DER GPCR-VERMITTELTEN EGFR
TRANSAKTIVIERUNG IN TUMORZELLEN 99
3.9.1 DIE G-PROTEIN-VERMITTELTE MIGRATION VON KREBSZELLEN IST EGFR- UND
METALLOPROTEASE-ABHAENGIG 99 3.9.2 ZUSAMMENFASSUNG DER WOUNDING-ASSAY
ERGEBNISSE: 102
3.9.3 EGFR- UND METALLOPROTEASE-ABHAENGIGE INVASION VON
PROSTATAKARZINOMZELLEN 102
4. DISKUSSION .....106
4.1 METALLOPROTEASE-ABHAENGIGE TRANSAKTIVIERUNG DES EGFRS DURCH
NEUROPEPTIDE IN TUMORZELLKULTUREN ( NEURO-PSYCHO/ONKO VERBINDUNG) 107
4.2 DOWNSTREAM -ANTWORTEN DER NEUROPEPTID-VERMITTELTEN EGFR
TRANSAKTIVIERUNG IN TUMORZELLEN 111
4.2.1 AKTIVIERUNG DES ADAPTERPORTEINS SHC UND DER MAPK 111
4.2.2 EINFLUSS DER SIGNALMOLEKUELE AKT UND FAK 112
4.2.3 ROLLE DER PKC 113
4.3 HB-EGF ALS VERMITTLER DER NEUROPEPTID-VERMITTELTEN EGFR
TRANSAKTIVIERUNG IN PC3 PROSTATAKARZINOMZELLEN 115
4.4 PATHOPHYSIOLOGISCHE ROLLE DER GPCR-VERMITTELTEN EGFR
TRANSAKTIVIERUNG IN TUMORZELLEN... 118
4.5 AUSBLICK 120
IMAGE 4
IV
INHALTSVERZEICHNIS
5. ZUSAMMENFASSUNG 1 2 2
6. SUMMARY 1 2 4
7. LITERATURVERZEICHNIS 1 2 6
PUBLIKATIONEN 1 4 2
POSTERBEITRAEGE 142
PRAESENTATIONEN 143
PATENTE - 143
8. ABKUERZUNGEN 1 4 4
9. DANKSAGUNG 1 4 7
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| spelling | Leserer, Michael Andreas Verfasser aut Untersuchungen zur pathophysiologischen Funktion der G-Protein-vermittelten Transaktivierung des epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptors in Tumorzellen Michael Andreas Leserer 2012 VI, 147 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier München, Techn. Univ., Diss., 2012 Tumorwachstum (DE-588)4186432-3 gnd rswk-swf G-Protein gekoppelter Rezeptor (DE-588)7723480-7 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content G-Protein gekoppelter Rezeptor (DE-588)7723480-7 s Tumorwachstum (DE-588)4186432-3 s DE-604 Erscheint auch als Online-Ausgabe urn:nbn:de:bvb:91-diss-20120327-1063819-0-6 http://mediatum.ub.tum.de/node?id=1063819 Verlag kostenfrei Volltext https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:91-diss-20120327-1063819-0-6 Resolving-System DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=025778485&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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