Charakterisierung und Messung der Translokation der bakteriellen Flora bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen:
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2006
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis 4
Abbildungsverzeichnis 8
Tabellenverzeichnis 10
Abkürzungsverzeichnis 11
1 Einleitung 13
1.1 Chronisch entzündliche Dannerkrankungen und Pouchitis 13
1.2 Rolle der Bakterien in der Pathogenese der chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen 14
1.3 Methoden zur Analyse der bakteriellen Flora 15
1.3.1 Kulturabhängige Untersuchungen 15
1.3.2 Kulturunabhängige Untersuchungen 16
1.4 Beschreibung der gastrointestinalen Mikroflora 16
1.4.1 Mikrobiota bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen 16
1.4.2 Denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE) 17
1.4.3 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) 18
1.5 Darmepithel als Barriere 18
1.5.1 Permeabilität bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen 19
1.6 Bakterielle Translokation in vivo und in vitro 19
1.7 Fragestellung 20
1.7.1 Charakterisierung der bakteriellen Mikroflora bei Morbus Crohn Patienten _ 20
1.7.1.1 Gibt es Unterschiede in der Mikroflora von MC und Kontrollen? 20
1.7.1.2 Findet eine bakterielle Translokation statt? 20
1.7.1.3 Gibt es krankheitstypische Veränderungen der Darmflora? 20
1.7.2 Intramurales Vorkommen von Bakterien 21
1.7.2.1 In welchen Gewebeschichten lassen sich die permeierten E. coli bzw. B.
frag/7/s Bakterien finden? 21
1.7.2.2 Lassen sich Faktoren bezüglich eines erhöhten intramuralen Vorkommens
bestimmen? 21
1.7.2.3 Korreliert die in vitro Translokation mit einem intramuralen
Bakterienvorkommen? 21
2 Material und Methoden 22
2.1 Chemikalien, Medien und Geräte 22
2.2 Denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE) 26
2.2.1 Versuchsaufbau 26
Inhaltsverzeichnis 5
2.2.2 Patientenkollektiv 27
2.2.3 Aufbereitung der Präparate 27
2.2.4 Aufarbeitung der Proben und DNA Isolierung 28
2.2.4.1 Prinzip der DNA Isolierung mittels Silikamilch und Alkoholfällung 28
2.2.4.2 Spülung der Proben und DNA Isolierung 29
2.2.5 Vervielfältigung der bakteriellen DNA 29
2.2.5.1 Prinzip der Polymerasekettenreaktion 29
2.2.5.2 Amplifizierung der bakteriellen DNA 29
2.2.5.3 Agarose Gelelektrophorese der PCR Produkte 31
2.2.5.4 Nachweisgrenze der PCR 31
2.2.6 Herstellung eines Bakterienmarkers 32
2.2.6.1 Anzucht von anaeroben Bakterien 32
2.2.6.2 Bestimmung der Zellzahl nach Thoma 32
2.2.7 Denaturierende Gradientengelelektrophorese 32
2.2.7.1 Prinzip der DGGE 32
2.2.7.2 Herstellung des DGGE Polyacrylamidgels mit linearen Harnstoff /Formamid
Gradienten 33
2.2.7.3 DGGE Elektrophorese 33
2.2.7.4 Silberfärbung 34
2.2.7.4.1 Detektionsgrenze der Silberfärbung 34
2.2.8 Identifizierung der DGGE Banden 34
2.2.8.1 DNA Extraktion aus DGGE Gelen 34
2.2.8.2 PCR und Reinigung der PCR Produkte 35
2.2.8.3 Prinzip der Sequenzierung nach Sanger 36
2.2.8.3.1 Sequenzierung 36
2.2.9 Statistik 37
2.3 Fluoreszenz in situ Hybridisierung 38
2.3.1 Durchführung der Ussing Kammer Versuche 38
2.3.2 Präparate 39
2.3.3 Vorbereitung der FISH Proben 40
2.3.4 Hybridisierung 40
2.3.5 Mikroskopische Auswertung und histologische Morphometrie 41
2.3.6 Statistik 42
3 Ergebnisse 43
3.1 Charakterisierung der Mikroflora bei Morbus Crohn Patienten 43
3.1.1 Detektionsgrenze der DGGE PCR von Reinkulturen und in Gewebe 43
i
Inhaltsverzeichnis g
3.1.2 Quantifizierung der DNA Konzentration einer DGGE Bande 45
3.1.3 Vergleich der DGGE Profile zwischen MC Patienten und Kontrollen 45
3.1.3.1 Reproduzierbarkeit der DGGE Profile 46
3.1.3.2 Vergleich der DGGE Muster der einzelnen Schichten zwischen MC und
Kontrollen 46
3.1.3.3 Vergleich der DGGE Profile zwischen den Darmwandschichten eines
Patientens 49
3.1.3.4 Gruppenspezifische Banden 51
3.1.3.5 Sequenzierungsergebnisse 51
3.2 Intramurales Vorkommen von Bakterien 55
3.2.1 £. co// Versuch 55
3.2.1.1 Flächenmessung 55
3.2.1.2 Permeation und Lokalisation der Bakterien 55
3.2.2 Bacteroides fragilis Versuch 58
3.2.2.1 Flächenmessung 58
3.2.2.2 Permeation und Lokalisation der Bakterien 58
3.2.3 Pouch Versuch 61
3.2.3.1 Messung der mukosalen Gewebelänge und Fläche der Submukosa 61
3.2.3.2 Permeation und Lokalisation der Bakterien 61
3.2.4 Korrelation der translozierten Bakterien mit einem intramuralen Vorkommen 65
4 Diskussion 67
4.1 Charakterisierung der Mikroflora bei Morbus Crohn Patienten 67
4.1.1 Methodenentwicklung 67
4.1.2 Bakterielle Besiedlung von MC und Kontrollen 67
4.1.2.1 Ähnlichkeiten zwischen MC und Kontroll Gruppe 67
4.1.2.2 Vergleich der DGGE Profile zwischen den Darmwandschichten eines
Patienten 69
4.1.2.3 Sequenzierung 70
4.1.2.4 Nachweis von Pseudomonas sp. in allen Darmwandschichten, Ursache und
Bedeutung 72
4.2 Intramurales Vorkommen von Bakterien 74
4.2.1 Vergleich der Proben 75
4.2.2 Lokalisation der Bakterien 75
4.2.3 Korrelation der in vitro translozierenden Bakterien mit einem intramuralen
Vorkommen 76
4.2.4 Bakterielle Translokation 77
Inhaltsverzeichnis 7
5 Zusammenfassung 79
6 Anhang 81
7 Literatur 94
8 Danksagung 101
9 Lebenslauf 102
10 Erklärung »03
|
| adam_txt |
Inhaltsverzeichnis 4
Abbildungsverzeichnis 8
Tabellenverzeichnis 10
Abkürzungsverzeichnis 11
1 Einleitung 13
1.1 Chronisch entzündliche Dannerkrankungen und Pouchitis 13
1.2 Rolle der Bakterien in der Pathogenese der chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen 14
1.3 Methoden zur Analyse der bakteriellen Flora 15
1.3.1 Kulturabhängige Untersuchungen 15
1.3.2 Kulturunabhängige Untersuchungen 16
1.4 Beschreibung der gastrointestinalen Mikroflora 16
1.4.1 Mikrobiota bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen 16
1.4.2 Denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE) 17
1.4.3 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) 18
1.5 Darmepithel als Barriere 18
1.5.1 Permeabilität bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen 19
1.6 Bakterielle Translokation in vivo und in vitro 19
1.7 Fragestellung 20
1.7.1 Charakterisierung der bakteriellen Mikroflora bei Morbus Crohn Patienten _ 20
1.7.1.1 Gibt es Unterschiede in der Mikroflora von MC und Kontrollen? 20
1.7.1.2 Findet eine bakterielle Translokation statt? 20
1.7.1.3 Gibt es krankheitstypische Veränderungen der Darmflora? 20
1.7.2 Intramurales Vorkommen von Bakterien 21
1.7.2.1 In welchen Gewebeschichten lassen sich die permeierten E. coli bzw. B.
frag/7/s Bakterien finden? 21
1.7.2.2 Lassen sich Faktoren bezüglich eines erhöhten intramuralen Vorkommens
bestimmen? 21
1.7.2.3 Korreliert die in vitro Translokation mit einem intramuralen
Bakterienvorkommen? 21
2 Material und Methoden 22
2.1 Chemikalien, Medien und Geräte 22
2.2 Denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE) 26
2.2.1 Versuchsaufbau 26
Inhaltsverzeichnis 5
2.2.2 Patientenkollektiv 27
2.2.3 Aufbereitung der Präparate 27
2.2.4 Aufarbeitung der Proben und DNA Isolierung 28
2.2.4.1 Prinzip der DNA Isolierung mittels Silikamilch und Alkoholfällung 28
2.2.4.2 Spülung der Proben und DNA Isolierung 29
2.2.5 Vervielfältigung der bakteriellen DNA 29
2.2.5.1 Prinzip der Polymerasekettenreaktion 29
2.2.5.2 Amplifizierung der bakteriellen DNA 29
2.2.5.3 Agarose Gelelektrophorese der PCR Produkte 31
2.2.5.4 Nachweisgrenze der PCR 31
2.2.6 Herstellung eines Bakterienmarkers 32
2.2.6.1 Anzucht von anaeroben Bakterien 32
2.2.6.2 Bestimmung der Zellzahl nach Thoma 32
2.2.7 Denaturierende Gradientengelelektrophorese 32
2.2.7.1 Prinzip der DGGE 32
2.2.7.2 Herstellung des DGGE Polyacrylamidgels mit linearen Harnstoff /Formamid
Gradienten 33
2.2.7.3 DGGE Elektrophorese 33
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2.2.7.4.1 Detektionsgrenze der Silberfärbung 34
2.2.8 Identifizierung der DGGE Banden 34
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2.2.8.2 PCR und Reinigung der PCR Produkte 35
2.2.8.3 Prinzip der Sequenzierung nach Sanger 36
2.2.8.3.1 Sequenzierung 36
2.2.9 Statistik 37
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2.3.3 Vorbereitung der FISH Proben 40
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2.3.6 Statistik 42
3 Ergebnisse 43
3.1 Charakterisierung der Mikroflora bei Morbus Crohn Patienten 43
3.1.1 Detektionsgrenze der DGGE PCR von Reinkulturen und in Gewebe 43
i
Inhaltsverzeichnis g
3.1.2 Quantifizierung der DNA Konzentration einer DGGE Bande 45
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3.1.3.3 Vergleich der DGGE Profile zwischen den Darmwandschichten eines
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3.1.3.4 Gruppenspezifische Banden 51
3.1.3.5 Sequenzierungsergebnisse 51
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4 Diskussion 67
4.1 Charakterisierung der Mikroflora bei Morbus Crohn Patienten 67
4.1.1 Methodenentwicklung 67
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Bedeutung 72
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4.2.2 Lokalisation der Bakterien 75
4.2.3 Korrelation der in vitro translozierenden Bakterien mit einem intramuralen
Vorkommen 76
4.2.4 Bakterielle Translokation 77
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