Funktionsaufklärung von CYR61 und CTGF in mesenchymalen Stammzellen und Lungenendothelzellen:
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2014
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|---|---|
| adam_text | FUNKTIONSAUFKLAERUNG VON CYR61 UND CTGF
IN MESENCHYMALEN STAMMZELLEN UND
LUNGENENDOTHELZELLEN
DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DES NATURWISSENSCHAFTLICHEN DOKTORGRADES
DER
JULIUS-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET WUERZBURG
VORGELEGT VON
RODERICH LAUG
AUS HALLE/S.
WUERZBURG, 2014
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1. ZUSAMMENFASSUNG 1
1.1. SUMMARY 2
2. EINLEITUNG 4
2.1. CCN-FAMILIE 4
2.1.1. ENTDECKUNG 4
2.1.2. STRUKTURELLER AUFBAU 5
2.1.3. FUNKTIONEN DER PROTEINE 6
2.2. CYR61 UND CTGF: MITGLIEDER DER CCN-FAMILIE IM FOKUS 8
2.2.1. CYR61
-CYSTEINE RIEH PROTEIN 61 8
2.2.1.1. CYR61 UND DIE ANGIOGENESE 9
2.2.1.2. CYR61 UND DIE LUNGE 10
2.2.1.3. CYR61 UND DAS MUSKULOSKELETTALE SYSTEM 10
2.2.2. CTGF-CONNECTIVE TISSUE GROWTH FACTOR 11
2.2.2.1. CTGF UND DIE LUNGE 11
2.2.2.2. CTGF UND DAS MUSKULOSKELETTALE SYSTEM 12
2.3. ZELLSYSTEME 13
2.3.1. HMSC UND DAS MUSKULOSKELETTALE SYSTEM 13
2.3.2. HPMEC-ST1.6R LUNGENENDOTHELZELLEN 14
2.4. ZIELE DIESER ARBEIT 15
3. MATERIAL UND METHODEN 18
3.1. MATERIAL 18
3.1.1. VERBRAUCHSMATERIAL 18
3.1.2. GERAETE 19
3.1.3. CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 20
3.1.4. ZELLKULTUR 22
3.1.5. BAKTERIENZELLEN 22
3.1.6. ANTIKOERPER 23
3.1.7. CDNA KLON 23
3.1.8. REKOMBINANTE PROTEINE 23
3.1.9. LENTIVIRALES SYSTEM 24
3.1.10. KITS 25
3.1.11. ENZYME 25
3.1.12. PRIMER 27
3.1.13. PUFFER UND SONSTIGE LOESUNGEN 30
3.1.14. SOFTWARE UND ONLINE QUELLEN 35
3.2. METHODEN 36
3.2.1. ZELLKULTUR 36
3.2.1.1. KULTIVIERUNG VON HPMEC-ST1.6R-ZELLEN 36
3.2.1.2. ISOLIERUNG UND KULTIVIERUNG VON HMSC 36
3.2.1.3. KULTIVIERUNG VON HEK293T-ZELLEN 37
3.2.1.4. KULTIVIERUNG VON EAHY926-ZELLEN 37
3.2.1.5. KULTIVIERUNG VON SF21-INSEKTENZELLEN 37
3.2.2. ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 38
3.2.2.1. HERUNTERREGULATION DER EXPRESSION VON CTGF UND CYROEL 38
3.2.2.2. BEHANDLUNG MIT REKOMBINANTEN PROTEINEN 39
3.2.2.3. KRYOKONSERVIERUNG EUKARYONTISCHER ZELLEN 39
3.2.2.4. ZELLZAHLBESTIMMUNG 40
3.2.3. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 41
3.2.3.1. REVERSE TRANSKRIPTASE POLYMERASE KETTENREAKTION (RT-PCR) 41
3.2.3.2. RNA-ISOLIERUNG AUS ZELLEN 41
3.2.3.3. RESTRIKTIONSVERDAU 42
3.2.3.4. PRAEPARATIONEN VON PLASMID-DNA 42
3.2.3.5. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 43
3.2.3.6. DNA-SEQUENZIERUNG 43
3.2.3.7. TRANSFORMATION IN PROKARYONTISCHE ZELLEN 44
3.2.3.8. MICROARRAY-ANALYSE 45
3.2.4. PROTEINANALYTIK 46
3.2.4.1. PROTEINISOLIERUNG AUS ZELLEN 46
3.2.4.2. PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 46
3.2.4.3. SDS-PAGE 47
3.2.4.4. WESTERNBLOT 48
3.2.4.5. SILBERGELFAERBUNG 49
3.2.5. KLONIERUNG DES OFFENEN LESERAHMENS VON CTGF 49
3.2.5.1. GEWINNUNG VON CTGF-PLASMID-DNA 49
3.2.5.2. TOPO-KLONIERUNG 50
3.2.5.3. LIGATION MIT PBACPAK8-VEKTOR 51
3.2.5.4. LIGATION MIT IGG-FC-DOMAENE 52
3.2.6. GEWINNUNG VON REKOMBINANTEM CTGF 52
3.2.6.1. BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM 52
3.2.6.2. AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE: AUFREINIGUNG VON RCTGF 54
3.2.7. PROLIFERATIONSASSAY 54
3.2.7.1. PROLIFERATION NACH HERUNTERREGULATION VON CTGF 54
3.2.7.2. FUNKTIONSTEST VON RCTGF 55
4. ERGEBNISSE 56
4.1. KLONIERUNG DES OFFENEN LESERAHMENS VON CTGF 56
4.1.1. AMPLIFIZIERUNG VON CTGF 56
4.1.2. TOPO-KLONIERUNG 56
4.1.3. LIGATION MIT DEM TRANSFERVEKTOR PBACPAK8 57
4.1.4. LIGATION MIT DEM FC-7AG 58
4.2. PRODUKTION UND AUFREINIGUNG VON REKOMBINANTEM CTGF 59
4.2.1. PRODUKTION VON REKOMBINANTEM CTGF 59
4.2.2. AUFREINIGUNG VON REKOMBINANTEM CTGF 60
4.2.3. REKOMBINANTE PROTEINE: FUNKTIONSTEST 63
4.3. HERUNTERREGULATION VON CTGFLCTGF IN HPMEC-ST1.6R-ZELLEN UND HMSC 65
4.3.1. HERUNTERREGULATION VON CTGF/CTGF IN HPMEC-ST1.6R-ZELLEN 66
4.3.2. HERUNTERREGULATION VON CTGFLCYGY IN HMSC 69
4.3.3. VERAENDERTES PROLIFERATIONSVERHALTEN NACH HERUNTERREGULATION VON
CTGFLCTGF 70
4.3.4. ZEITLICHER VERLAUF DER HERUNTERREGULATION 72
4.4. HERUNTERREGULATION VON CYR61/CYR.6 IN HPMEC-ST1.6R-ZELLEN UND HMSC
75
4.4.1. HERUNTERREGULATION VON CYR61ICYK6 IN HPMEC-ST1.6R-ZELLEN 75
4.4.2. HERUNTERREGULATION VON CYR6HCYR61 IN HMSC 77
*
4.5. AFFYMETRIX MICROARRAY-ANALYSE 79
4.5.1. HPMEC-ST1.6R-ZELLEN 79
4.5.1.1. UEBERPRUEFUNG DER HPMEC-ST1.6R-ZELL-VERSUCHSANSAETZE 79
4.5.1.2. AFFYMETRIX GENECHIP HG-U 133 PLUS 2.0 81
4.5.1.3. VALIDIERUNG DER HPMEC-ST1.6R MICROARRAY-DATEN DURCH RT-PCR 86
4.5.1.4. ZUORDNUNG VON GENREGULATIONEN NACH GENE ONTOLOGY (GO) UND KEGG
88
4.5.2. HMSC : 93
4.5.2.1. UEBERPRUEFUNG DER HMSC-VERSUCHSANSAETZE 93
4.5.2.2. AFFYMETRIX GENECHIP HG-U 133 PLUS 2.0 95
4.5.2.3. VALIDIERUNG DER HMSC MICROARRAY-DATEN DURCH RT-PCR 100
4.5.2.4. ZUORDNUNG VON GENREGULATIONEN NACH GENE ONTOLOGY (GO) UND KEGG
102
4.6. BEHANDLUNG MIT REKOMBINANTEN PROTEINEN: TGFB2, RCTGF 107
5. DISKUSSION 110
5.1. REKOMBINANTES CTGF (RCTGF) 110
5.1.1. VON DER KLONIERUNG BIS ZUR AUFREINIGUNG 110
5.1.2. PROTEINGEWINNUNG-EINE KRITISCHE BETRACHTUNG 111
5.1.3. STABILITAET UND FUNKTION 112
5.2. HERUNTERREGULATION DER ENDOGENEN CYR6J/CYR6 - ODER
CTGF/CTGF-EXPRESSION 115
5.2.1. LUNGENENDOTHELZELLEN: HERUNTERREGULATION DER CTGFLCYGF-EXPRESSION
FUHRT ZU VERRINGERTEM
PROLIFERATIONSVERHALTEN 115
5.2.2. HUMANE MESENCHYMALE STAMMZELLEN: HERUNTERREGULATION DER
CTGFICTGY-EXPRESSION FUEHRT ZU
VERRINGERTEM PROLIFERATIONSVERHALTEN 116
5.2.3. KEIN REGULATORISCHER EFFEKT VON SHRNAS AUF DIE ENDOGENE
EXPRESSION VON CYROELLCYR61 IN
HMSC UND HPMEC-ST1.6R-ZELLEN 117
5.3. MICROARRAY-ANALYSE: ZAHLREICHE GENREGULATIONEN NACH
HERUNTERREGULATION DER CFG/7CTGF-EXPRESSION
IN HMSC UND HPMEC-ST1,6R-ZELLEN 118
5.3.1. DER TGFSS-SIGNALWEG 118
5.3.2. CTGF UND DER EINFLUSS VON TRANSFORMINGGROWTH FACTOR BETA 120
5.3.3. CTGF UND TGFB2: EIN MOEGLICHER ZUSAMMENHANG IN DER
LUNGENENTWICKLUNG 121
5.3.4. CTGF UND TGFSS2 UND DAS MUSKULOSKELETTALE SYSTEM 122
5.3.5. SCHLUSSWORT 124
6. LITERATURVERZEICHNIS 126
7. ANHANG 136
7.1. HPMEC-ST1.6R MICROARRAY-TABELLEN 136
7.1.1. REGULIERTE PROBE SETS IN DER HPMEC-ST1.6R MICROARRAY-ANALYSE 136
7.1.2. GENREGULATIONEN NACH EINTEILUNG IN GO-KATEGORIEN 143
7.1.3. ZUORDNUNG REGULIERTER GENE ZU SIGNALWEGEN NACH KEGG 162
*
7.2. HMSC M CROA
/RARY
-TABELLEN 164
7.2.1. REGULIERTE PROBE SETS IN DER HMSC MICROARRAY-ANALYSE 164
7.2.2. GENREGULATIONEN NACH EINTEILUNG IN GO-KATEGORIEN 173
7.2.3. ZUORDNUNG REGULIERTER GENE ZU SIGNALWEGEN NACH KEGG 189
7.3. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 191
7.4. PUBLIKATIONEN UND KONGRESSBEITRAEGE 192
7.5. DANKSAGUNG ! 193
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