Identifikation molekularer Mechanismen der kardialen Fibrosierung bei der Coxsackievirus B3-induzierten chronischen Myokarditis:
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Autor: Lang, Christine Renate
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 Entzündliche Herzmuskelerkrankungen 2
1.1.1 Myokarditis und inflammatorische Kardiomyopathie 2
1.1.2 Ätiologie der Myokarditis 3
1.1.3 Verlauf und Prognose entzündlicher Herzmuskelerkrankungen 4
1.1.4 Diagnostik entzündlicher Herzmuskelerkrankungen 5
1.2 Coxsackievlren - humanpathogene Enterovlren aus der Familie
der Picornavtridae 6
1.2.1 Klassifikation der Picornaviridae 6
1.2.2 Aufbau und Genomstruktur der Enteroviren 6
1.2.3 Infektions- und Replikationszyklus der Enteroviren 7
1.2.4 Coxsackieviren 9
1.2.4.1 Pathogenese und Klinik der coxsackieviralen Infektion 9
1.2.4.2 Die coxsackievirale Infektion in vitro 10
1.3 Die enterovirale Herzerkrankung 11
1.3.1 Ätiopathogenetische Zusammenhänge von akuter Myokarditis
und dilatativer Kardiomyopathie 11
1.3.2 Mausmodell der akuten und chronischen Coxsackievirus B3
(CVB3)-induzierten Myokarditis 12
1.3.3 Pathogenese der CVB3-Myokarditis im Mausmodell 13
1.3.4 Die chronische Myokarditis als Folge der Enteroviruspersistenz 13
1.4 Kardiale Fibröse als Folge der chronischen enteroviralen
Myokarditis 14
1.4.1 Remodellierung der extrazellulären Matrix bei der Enterovirus-
induzierten dilatativen Kardiomyopathie 15
1.4.2 Relevante Signalmoleküle für die Kollagensynthese bei der
Fibröse 17
1.4.2.1 „Connective tissue growth factor (CTGF): ein zentraler
Mediator bei der Fibroseentstehung 18
1.4.2.1.1 Funktionelle Bedeutung und Fibroserelevanz von CTGF 19
I
Inhaltsverzeichnis
1.4.2.1.2 Mechanismen der Signaltransduktion durch CTGF 22
1.4.2.1.3 Gen-und Proteinstruktur von CTGF 24
1.4.2.2 „Transforming growth factor beta (TGFß): ein Zytokin mit
profibrotischen Effekten 25
1.4.2.3 Die Proteinkinase B (PKB/Akt) 27
1.4.2.4 Die Serum- und Glukokortikoid-induzierbare Kinase 1 (SGK1) 28
1.5 Fragestellung der Arbeit 30
2. MATERIAL UND METHODEN 32
2.1 Material 32
2.1.1 Laborgeräte und Bedarfsgegenstände 32
2.1.2 Verbrauchsartikel 32
2.1.3 Chemikalien 33
2.1.4 Zellkulturmedien und-Zusätze 35
2.1.5 Enzyme 35
2.1.6 Nukleotide, Nukleinsäuren und Proteine 36
2.1.7 Plasmide 36
2.1.8 Bakterien 37
2.1.9 Antikörper 37
2.1.10 Viren 37
2.1.11 Versuchstiere - ingezüchteter Mausstamm 37
2.2 Methoden 38
2.2.1 Kultivierung von Verozellen 38
2.2.2 Virologische Methoden 38
2.2.2.1 Virusvermehrung 38
2.2.2.2 Virustitration 39
2.2.3 Das Mausmodell der Coxsackievirus B3 (CVB3)-induzierten
Myokarditis 40
2.2.3.1 Das Coxsackievirus B3 (CVB3) 40
2.2.3.2 Versuchstiere und Tierhaltung 40
2.2.3.3 Gruppeneinteilung und Versuchsaufbau 41
2.2.3.4 Organentnahme und Gewebepräparation 41
II
Inhaltsverzeichnis
2.2.3.5 Anfertigung von Gewebeschnitten für die Histologie,
Immunhistologie und in situ Hybridisierung 42
2.2.3.5.1 Vorbehandlung der Objektträger 42
2.2.3.5.2 Herstellung von Paraffinschnittpräparaten 43
2.2.3.5.3 Herstellung von Kunststoffschnittpräparaten 43
2.2.4 In vitro Modell der Coxsackievirus B3 (CVB3)-Infektion 43
2.2.4.1 Präparation von Fibroblasten aus dem Mausherz 43
2.2.4.2 Infektion der Zellen und Versuchsplan 45
2.2.5 Isolierung von Gesamt-RNA 45
2.2.5.1 Präparative RNA-Isolierung aus Myokardgewebe 45
2.2.5.2 Präparative RNA-Isolierung aus murinen Herzfibroblasten 47
2.2.5.3 RNA-Konzentrationsbestimmung 48
2.2.5.4 Native RNA-Agarosegelelektrophorese 48
2.2.6 Genexpressionsanalyse mittels DNA-Microarray 49
2.2.7 Quantitative „Realtime RT-PCR 50
2.2.7.1 Genexpressionsanalyse mittels „Two-Step „Realtime RT-PCR 50
2.2.7.1.1 Reverse Transkription 50
2.2.7.1.2 „Realtime PCR 51
2.2.7 .1..3 Native DNA-Agarosegelelektrophorese 53
2.2.7.2 Nachweis viraler RNA mittels „One-Step „Realtime RT-PCR 53
2.2.8 RNA/RNA OTS/fu Hybridisierung 54
2.2.8.1 Herstellung der Nukleinsäuresonden 55
2.2.8.1.1 Präparation von rekombinanten Plasmiden 56
2.2.8.1.2 Linearisierung der Plasmide 57
2.2.8.1.3 Phenolextraktion 58
2.2.8.1.4 Ethanolfällung 58
2.2.8.1.5 Radioaktive Markierung der RNA-Sonden 58
2.2.8.1.6 Limitierte alkalische Hydrolyse der radioaktiv
markierten RNA-Sonden 59
2.2.8.1.7 Native RNA-Agarosegelelektrophorese 60
2.2.8.2 Vorbehandlung der Paraffinschnittpräparate 60
2.2.8.3 Permeabilisierung der Gewebeschnitte 60
III
Inhaltsverzeichnis
2.2.8.4 Hybridisierung der Gewebeschnitte 61
2.2.8.5 Posthybridisierung 62
2.2.8.6 Nachweis der radioaktiv markierten RNA-Sonden 63
2.2.9 Proteinnachweis mittels Western Blot 64
2.2.9.1 Proteinextraktion aus Myokardgewebe und murinen
Herrfibroblasten 64
2.2.9.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Transfer der
aufgetrennten Proteine 65
2.2.9.3 Proteinnachweis mittels Chemilumineszenz 66
2.2.10 Proteinnachweis mittels Immunhistochemie 69
2.2.11 Morphologische Analyse der myokardialen Gewebever¬
änderungen 71
2.2.11.1 Lichtmikroskopie 71
2.2.11.2 Elektronenmikroskopie (ESI) 72
2.2.12 Statistik 73
3. ERGEBNISSE 74
3.1 Ergebnisse der Virustitration 74
3.2 In vivo Modell der Coxsackievirus B3 (CVB3)-Infektlon 75
3.2.1 Tierversuchsplan 75
3.2.2 Histopathologische Myokardbefunde nach CVB3-Infektion 75
3.2.3 Nachweis coxsackieviraler RNA im Myokard CVB3-infizierter
Mäuse mittels radioaktiver RNA/RNA in situ Hybridisierung 77
3.2.4 Identifikation einer veränderten Genexpression im Myokard
CVB3-infizierter Mäuse durch Microarray-Analyse 79
3.2.5 Quantitativer und qualitativer Nachweis von CTGF mRNA und
Protein im Myokard nicht-infizierter und CVB3-infizierter Mäuse 80
3.2.5.1 Quantitative Analyse der CTGF Expression im Verlauf der
Myokarditis mittels „Realtime RT-PCR und Western Blot 80
3.2.5.2 Analyse der myokardialen Lokalisation von CTGF mittels
RNA/RNA in situ Hybridisierung und Immunhistochemie 83
3.2.6 Quantitativer und qualitativer Nachweis von TGFB1 mRNA im
Myokard nicht-infizierter und CVB3-infizierter Mäuse 88
IV
Inhaltsverzeichnis
3.2.6.1 Quantitative Analyse der TGFB1 Expression im Verlauf der
Myokarditis mittels „Realtime RT-PCR 89
3.2.6.2 Analyse der myokardialen Lokalisation von TGFB1 mittels
RNA/RNA in situ Hybridisierung 90
3.2.7 Quantitativer und qualitativer Nachweis von SGK1 mRNA im
Myokard nicht-intizierter und CVB3-infizierter Mäuse 91
3.2.7.1 Quantitative Analyse der SGK1 Expression im Verlauf der
Myokarditis mittels „Realtime RT-PCR 92
3.2.7.2 Analyse der myokardialen Lokalisation der SGK1 mittels
RNA/RNA in situ Hybridisierung 93
3.2.8 Quantitativer und qualitativer Nachweis phosphorylierter Akt im
Myokard nicht-infizierter und CVB3-infizierter Mäuse 95
3.2.8.1 Quantitative Analyse der Expression phosphorylierter Akt im
Verlauf der Myokarditis mittels Western Blot 95
3.2.8.2 Analyse der myokardialen Lokalisation phosphorylierter Akt
mittels Immunhistochemie 96
3.2.9 Quantitativer und qualitativer Nachweis von Prokollagen Typ Icc2
mRNA und Kollagen im Myokard nicht-infizierter und CVB3-
infizierter Mäuse 97
3.2.9.1 Quantitative Analyse der Prokollagen Typ Ia2 Expression im
Verlauf der Myokarditis mittels „Realtime RT-PCR 98
3.2.9.2 Histologische Darstellung von Kollagen und morphometrische
Quantifizierung des Fibrosegrades im Verlauf der Myokarditis 99
3.3 In vitro Untersuchungen zur Coxsackievirus B3 (CVB3)-Infektion
an murinen Herzfibroblasten 102
3.3.1 Quantitativer Nachweis enteroviraler RNA in murinen Herz¬
fibroblasten mittels „Realtime RT-PCR 103
3.3.2 Quantitativer Nachweis von CTGF mRNA mittels „Realtime
RT-PCR und von CTGF Protein mittels Western Blot 104
3.3.3 Quantitativer Nachweis von TGFB1, SGK1 und Prokollagen
Typ Ia2 mRNA mittels „Realtime RT-PCR 106
3.3.4 Quantitativer Nachweis phosphorylierter Akt mittels Western Blot 108
V
Inhaltsverzeichnis
3.3.5 Einfluss des Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K)-Inhibitors Ly
294002 auf die CTGF und Prokollagen Typ Ia2 Expression nach
CVB3-Infektion 109
4. DISKUSSION 113
4.1 Kardiale Fibröse als Folge einer veränderten Prokollagen Typ I
Expression im Myokard CVB3-infizierter Mäuse 115
4.2 CTGF und TGFB: zwei wichtige Zytokine für die kardiale
Fibrosierung bei der CVB3-induzierten chronischen Myokarditis 117
4.3 Molekulare Mechanismen der Genregulation von CTGF 129
4.3.1 Die Proteinkinase B (PKB/Akt): posttranskriptionelle Aktivierung 134
4.3.2 Die Serum- und Glukokortikoid-induzierbare Kinase 1 (SGK1):
transkriptionelle Aktivierung 137
4.4 Schlussfolgerung 141
5. ZUSAMMENFASSUNG 143
6. LITERATURVERZEICHNIS 146
7. ABKÜRZUNGEN 181
8. ANHANG
8.1 Danksagung
8.2 Lebenslauf
VI
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