Etablierung und Evaluierung eines internen Standards zur Quantifizierung von Aspergillus-DNA:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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| Veröffentlicht: |
2009
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| adam_text | Titel: Etablierung und Evaluierung eines internen Standards zur Quantifizierung von Aspergillus-DNA
Autor: Kunz, Kerstin Nicole
Jahr: 2009
Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
1. Einleitung 1
1.1. Aspergillus Species 1
1.2. Risikopatienten 1
1.2.1. Allgemein 1
1.2.2. Stammzelltransplantation 2
1.2.3. Krankheitsbilder 4
1.3. Inzidenz 5
1.4. Diagnostik 6
1.4.1. Molekularbiologische Techniken 9
1.5. Therapiemöglichkeiten 10
1.6. Zielsetzung 12
2. Patienten, Material und Methoden 13
2.1. Pilzkulturen 13
2.1.1. Herstellung von Verdünnungsreihen 13
2.2. Kontaminationsmonitoring 14
2.3. Automatisierte DNA - Extraktion 14
2.3.1. Vorbehandlung der Proben 14
2.3.1.1. QIAmp DNA Tissue Kit 16
2.3.1.2. Zelldisruption 16
2.3.2. MagNA Pure LC™ 17
2.3.2.1. MAgNA Pure LC™ Software 19
2.3.2.2. MagNA Pure LC™ Gerätevorbereitung 20
2.3.2.3. MagNA Pure LC™ Extraktionsprotokolle 20
2.4. Amplifikations- und Detektionsprotokolle 20
2.4.1. Target - Sequenz der Amplifikationen: 18ssu rDNA 21
2.4.2. LightCycler™ - PCR 22
2.4.2.1. LightCycler™ - Sonden 24
2.4.2.2. LightCycler™ Ergebnis - Dokumentation 26
Inhaltsverzeichnis II
2.4.2.3. Schmelzkurvenanalyse 27
2.4.3. PCR / PCR - ELISA 27
2.4.4. Gelelektrophorese 29
2.5. Patientenproben 30
2.6. Herkunftsbezeichnungen 32
3. Ergebnisse 35
3.1. Etablierung des Standards 35
3.1.1. Herstellung einer Aspergillus fumigatus Verdünnungsreihe 35
3.1.2. Herstellen einer Standard-Verdünnungsreihe 36
3.1.3. Sensitivität 38
3.1.4. Spezifität 38
3.2. Patientenproben 38
3.2.1. Modifikation zur Auswertung für den Standard 39
3.2.1.1. 21 Proben plus 1 ul Standard 100 fg, 1,6 ul MgCI2 im
MasterMix 39
3.2.1.2. Selbe 21 Proben plus 2 ul Standard 100 fg, 1,6ulMgCI2
im MasterMix 40
3.2.1.3. Selbe 21 Proben plus 2 ul Standard 100 fg, 3,6 ul MgCI2
im MasterMix 40
3.2.1.4. 21 Proben plus 3 ul Standard 100 fg, 3,6 ul MgCI2 im
MasterMix 41
3.2.2. Auswertung des Standards 41
3.2.2.1. 101 Proben plus 2 ul Standard 100 fg, 3,6 ul MgCI2 im
MasterMix 42
3.3. Überprüfung möglicher Einschränkungen 42
3.3.1. Kryokonservierung 42
3.3.1.1. 44 Proben plus 2 ul Standard 100 fg, 3,6 ul MgCI2im
MasterMix 43
3.3.2. Inhibition 43
3.3.3. DNA-Extraktion aus Blut von Doktoranden bzw.
Laborpersonal 44
Inhaltsverzeichnis III
3.3.4. Patientenproben in Verdünnung 44
3.3.4.1. 20 Proben (101) plus 2 ul Standard 100 fg, 3,6 ul MgCI2 im
MasterMix: 45
3.3.4.2. 20 Proben (10 2) plus 2 ul Standard 100 fg, 3,6 ul MgCI2 im
MasterMix 45
3.3.5. Vergleich LightCycler™ und Wiederholung PCR-ELISA 46
4. Diskussion 47
4.1 Der gegenwärtige Wissensstand 47
4.2 Schwierigkeiten in der Diagnostik 48
4.3 Detektion von Aspergillus mittels PCR 49
4.4 Diskussion der Ergebnisse 50
4.4.1 Etablierung des Standards 50
4.4.2 Patientenproben 52
4.4.2.1 Kryokonservierung 53
4.4.2.2 Inhibition 54
4.4.2.3 Verdünnungsversuche 55
4.4.2.4 Vergleich LightCycler™ und Wiederholung PCR-ELISA 56
4.5 Schlussfolgerung 56
4. Zusammenfassung 58
Abbildungsverzeichnis 60
Tabellenverzeichnis 61
Abkürzungsverzeichnis 62
Literaturverzeichnis 65
Danksagung 76
Lebenslauf 77
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