Strukturelle und funktionelle Charakterisierung der B. subtilis scRNA:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1993
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 EINE NEUE FAMILIE VON KLEINEN, STABILEN RIBONUKLEINSAEUREN 1
1.2 DIE SRP-RNAS AUS EUKARYONTEN 1
1.3 DIE 7S RNAS AUS ARCHAEBAKTERIEN 4
1.4 DIE 4.5S RNAS AUS GRAM-NEGATIVEN EUBAKTERIEN 5
1.5 DIE SCRNAS AUS GRAM-POSITIVEN EUBAKTERIEN 7
1.6 PROBLEMSTELLUNG 9
2 MATERIAL 10
2.1 FEINCHEMIKALIEN UND LOESUNGSMITTEL 10
2.2 RADIOCHEMIKALIEN 11
2.3 ENZYME 11
2.4 GERAETE 11
2.5 DIVERSES 12
2.6 ZELLEN UND MEDIEN 12
2.7 PUFFER UND LOESUNGEN 14
3 METHODEN 15
3.1 ZELLAUFZUCHTEN 15
3.1.1 LAGERUNG BAKTERIELLER KULTUREN 15
3.2 REINIGUNG UND KONZENTRIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 16
3.2.1 PHENOLEXTRAKTION 16
3.2.2 ETHANOLPRAEZIPITATION 17
3.2.3 ISOPROPANOLPRAEZIPITATION 18
3.2.4 PHOTOMETRISCHE ANALYSE VON NUKLEINSAEURE-LOESUNGEN 18
3.3 ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 18
3.3.1 ISOLIERUNG DOPPELSTRAENGIGER DNA 18
3.3.1.1 ANALYTISCHE PLASMIDISOLIERUNG 19
3.3.1.2 PRAEPARATIVE PLASMIDISOLIERUNG NACH QIAGEN 19
3.3.1.3 PRAEPARATIVE PLASMIDISOLIERUNG AUS
B. SUBTILIS 21
3.3.2 ISOLIERUNG VON DNA FUER DIE SEQUENZIERUNG 23
3.3.2.1 ISOLIERUNG EINZELSTRAENGIGER BAKTERIOPHAGEN-DNA 23
3.3.2.2 ISOLIERUNG DOPPELSTRAENGIGER DNA 24
3.3.3 ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA 24
3.3.4 ISOLIERUNG VON RNA 25
3.4 METHODEN DER DNA-REKOMBINATION 25
3.4.1 SEQUENZSPEZIFISCHE SPALTUNGEN VON DNA 25
3.4.2 MODIFIKATION VON RESTRIKTIONSTERMINI 26
3.4.2.1 AUFLULLREAKTION 26
3.4.2.2 DEPHOSPHORYLIERUNG 27
3.4.2.3 PHOSPHORYLIERUNG 27
3.4.3 ANNAELING 28
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3.4.4 LIGATION 28
3.4.5 TRANSFORMATION VON
E. CO/Z-ZELLEN 29
3.4.5.1 HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN 29
3.4.5.2 PLASMIDTRANSFORMATION 30
3.45.3 M13 -RF-T RANSFORMATION 30
3 .4.6 ELEKTROTRANSFORMATION VON
B. SUBTILIS-ZEUEN 31
3.5 GELELEKTROPHORESEN 32
3.5.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 3 2
3.5.2 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESEN VON NUKLEINSAEUREN 33
3.5.2.1 DENATURIEREND POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 34
3.5.2.2 NATIVE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 34
3.5.23 DNA-SEQUENZIERUNGSGELELEKTROPHORESE 35
3.5.3 FAERBUNG UND PHOTOGRAPHIEREN VON NUKLEINSAEURE-GELEN 37
3.5.4 AUTORADIOGRAPHIE 37
3.5.5 GELELEKTROPHORESE VON PROTEINEN 3 8
3.5.5.1 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE IM HOMOGENEN TRENNGEL 38
3.5.5.2 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE IM GRADIELLEN TRENNGEL 39
3.5.6 FAERBUNG VON PROTEINGELEN 41
3.5.6.1 FAERBUNG MIT COOMASSIE-BRILLANTBLAU 41
3.5.6.2 SILBERFARBUNG 42
3.5.7 FLUOROGRAPHIE 42
3.5.8 PROBENPUFFER 42
3.5.8.1 DNA-PROBENPUFFER 42
3.5.8.2 RNA-PROBENPUFFER 43
3.5.83 PROTEIN-PROBENPUFFER 43
3.6 ELUTION VON NUKLEINSAEUREN 43
3.6.1 ELEKTROELUTION 43
3.6.2 DIFFUSIONSELUTION 44
3.6.3 EXTRAKTIONSELUTION 44
3.6.4 CHROMATOGRAPHISCHE AUFTRENNUNG VON DNA 4 5
3.7 MUTAGENESE 46
3.7.1 DESOXYOLIGONUKLEOTID-GERICHTETE MUTAGENESE NACH ECKSTEIN 46
3.7.2 DESOXYOLIGONUKLEOTID-GERICHTETE MUTAGENESE MITTELS PCR 47
3.8 SEQUENZIERUNG VON DNA 49
3.9 SOUTHERN BLOT-ANALYSE 50
3.10 NORTHERN BLOT-ANALYSE 52
3.11
IN VIVO PULS-MARKIERUNG VON PROTEINEN 53
4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 55
4.1 KONSTRUKTION UND CHARAKTERISIERUNG EINER
B. SUBTILIS-MUTANTE, 55
DEREN SCRNA-EXPRESSION REGULIERBAR IST
4.1.1 INAKTIVIERUNG DES .SCR-PROMOTORS 5 5
4.1.2 KONSTRUKTION DER P^/UESCR-GENFUSION 57
4.1.3
4.1.4
4.1.5
4.1.6
4.1.7
4.1.7.1
4.1.7.2
4.1.7.3
4.1.8
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.3
4.3.1
CHROMOSOMALE INTEGRATION DER P
X^/::SCR-GENFUSION IN
B. SUBTILIS
NACHWEIS DER PRV/::SCR-FUSION DURCH SOUTHERN BLOT-ANALYSE
NORTHERN BLOT-ANALYSE DER B. SUM/W-MUTANTE RKK8
WACHSTUMSANALYSE VON
B. SUBTILIS RKK8 BEI VERLUST
AN SC RNA
HOMOLOGE KOMPLEMENTATIONSANALYSE
KONSTRUKTION DER
DELETION DER
DNAX-REGION
WACHSTUMS-UND NORTHERN BLOT-ANALYSE
P22IT
STRUKTURELLE EINGRENZUNG DER ESSENTIELLEN SCRNA-REGION
KONSTRUKTION EINER P
5CA*:$S-GENFUSION
WACHSTUMS- UND NORTHERN BLOT-ANALYSE VON RKK8-
PGP45
FAZIT
FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DER
B. SUBTILIS SCRNA
FAZIT
5 ZUSAMMENFASSUNG
APPENDIX
A ABKUERZUNGEN
B LITERATUR
C EIGENE PUBLIKATIONEN UND ABSTRAKTE
CURRICULUM VITAE
DANKSAGUNG |
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