Eignung einer Gensonde zum Nachweis der Entwicklungsstadien von Fasciola hepatica LINNÉ 1758 im Zwischenwirt:
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| Sprache: | German |
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1999
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
13
2
SCHRIFTTUM.
15
2.1
FASZIOLOSE
BEI
HAUSTIEREN
.
15
2.1.1
ERREGER
.
15
2.1.2
VORKOMMEN
UND
WIRTSCHAFTLICHE
BEDEUTUNG
.
15
2.1.3
ENTWICKLUNG
VON
F.
HEPATICA
.
18
2.1.4
KLINIK
UND
PATHOGENESE
.
23
2.1.5
ZWISCHENWIRT
.
28
2.1.5.1
LEBENSBEDINGUNGEN/HABITATE
.
29
2.1.5.2
ENTWICKLUNGSZYKLUS
.
31
2.1.6
GEGENSEITIGE
ABHAENGIGKEITEN
VON
F.
HEPATICA
UND
L.
TRUNCATULA
.
34
2.1.7
EPIDEMIOLOGIE
DER
FASZIOLOSE
.
41
2.1.8
DIAGNOSE
UND
KONTROLLMOEGLICHKEITEN
.
47
2.1.8.1
EINZELTIERDIAGNOSTIK
IM
ENDWIRT
.
48
2.1.8.2
EPIDEMIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
.
50
2.1.8.2.1
UNTERSUCHUNGEN
UEBER
DEN
ZWISCHENWIRT
.
51
2.1.8.2.2
UNTERSUCHUNGEN
ANHAND
VON
VORHERSAGEMODELLEN
.
53
2.1.9
BEKAEMPFUNG
.
57
2.1.9.1
WEIDETECHNISCHE
MASSNAHMEN
.
58
2.1.9.2
ANTHELMINTHIKA
.
59
2.2
EPIDEMIOLOGISCHE
BETRACHTUNGEN
ZUR
GEWINNUNG
GEEIGNETEN
PROBENMATERIALS
.
62
2.3
DNA-ISOLIERUNG
.
64
2.4
REPETITIVE
GENSEQUENZEN
.
65
2.5
DNA-SONDEN
MIT
SPEZIFITAET
.
67
2.6
MARKIERUNGS
UND
DETEKTIONSVERFAHREN
FUER
SONDEN
.
69
2.7
BESTAENDIGKEIT
REPETITIVER
GENSEGMENTE
.
71
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.72
3.1
VERSUCHSPLAN
.
72
3.2
PARASITOLOGISCHES
PROBENMATERIAL
UND
DESSEN
AUFBEREITUNG
.
73
3.2.1
ADULTE
F.
HEPATICA
UND
F.
GIGONTICA-EXEMPLARE
.
73
3.2.2
ZWISCHENWIRTE
UND
DEREN
SAMMLUNG
.
74
3.2.3
ENTWICKLUNGSSTADIEN
VON
F.
HEPATICA
.
75
3.2.4
NEGATIVE
ZWISCHENWIRTE
GEMEINSAM
MIT
ENTWICKLUNGSSTADIEN
VON
F.
HEPATICA
.
76
3.2.5
WEITERE
TREMATODENEXEMPLARE
.
76
3.3
STRUKTUR
UND
AUSWAHL
F.
HEPATICA
POSITIVER
BETRIEBE
.
76
3.3.1
BETRIEBE
NR.
1
UND
2
IN
DER
REGION
'
ELBMARSCH
'
.
76
3.3.2
BETRIEBE
NR.
3
UND
4
IN
DER
REGION
'
WOLFSBURG
'
.
79
3.4
KOTPROBENENTNAHME
IN
DEN
BETRIEBEN
.
81
3.5
KOTUNTERSUCHUNG
.
82
3.6
KLIMADATEN
.
82
3.7
DNA-ISOLIERUNG
.
83
3.7.1
ISOLIERUNG
MITTELS
CHLOROFORM:ISOAMYLALKOHOL
.
83
3.7.2
ISOLIERUNG
MITTELS
SILICAMEMBRAN
.
84
3.8
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
DER
ISOLIERTEN
DNA
.
85
3.9
GELELEKTROPHORESETECHNIKEN
.
85
3.9.1
LAUFPUFFER
.
86
3.9.2
PROBENPUFFER
MIT
FARBSTOFF
.
86
3.9.3
GROESSENSTANDARDS
.
86
3.9.4
FAERBUNGEN
.
86
3.9.5
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
87
3.9.6
POYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
87
3.10
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(POLYMERASE
CHAIN
REACTION;
PCR)
MIT
FASCIOLA
SPEZIFISCHEN
PRIMERN
.
88
3.10.1
PRIMER
.
88
3.10.2
REAKTIONSBEDINGUNGEN
.
89
3.10.3
POLYMERASEN
UND
REAKTIONSANSAETZE
.
89
3.10.4
PCR-MATRIZEN
.
91
3.11
KLONIERUNG
DER
PCR-AMPLIFIKATE
.
92
3.11.1
AUFREINIGUNG
DER
PCR-AMPLIFIKATE
.
93
3.11.2LIGATION
.
93
3.11.3
TRANSFORMATION
.
94
3.12
PLASMID-PRAEPARATION
UND
DARSTELLUNG
DER
INSERTS
.
95
3.12.1
MINIPREP-ANSAETZE
.
95
3.12.2
MIDIPREP-ANSAETZE
.
95
3.12.3
RESTRIKTIONSENZYMVERDAU
VON
DNA
REKOMBINANTER
KLONE
.
96
3.13
SEQUENZIERUNG
DER
INSERTS
.
96
3.13.1
AUTOMATISCHE
SEQUENZIERUNG
.
96
3.14
SEQUENZIDENTITAETSVERGLEICH
MITTELS
EMBL-DATENBANK
.
98
3.15
SEQUENZIDENTITAETSVERGLEICH
MIT
ALIGNYY
.
98
3.16
'
SOUTHERN
BLOTTING
'
,
'
DNA
DOT
BLOTTING
'
UND
GENSONDENHYBRIDISIERUNG
.
99
3.16.1
'
SOUTHERN
BLOTTING
'
.
100
3.16.2
'
DNA
DOT
BLOTTING
'
.
101
3.16.3
HERSTELLUNG
EINER DIG-MARKIERTEN
DNA-SONDE
VON
F.
HEPATICA
.
102
3.16.4
UEBERPRUEFUNG
DER
DIG-MARKIERTEN
DNA-SONDE
.
103
3.16.5
HYBRIDISIERUNG
UND
DETEKTION
.
104
3.17
MRNA-ISOLIERUNG
.
105
3.18
CDNA-SYNTHESE
.
105
3.19
CDNA-POLYMERASE-KETTENREAKTION
(CDNA-PCR)
.
107
3.19.1
PRIMER
.
108
3.19.2
REAKTIONSBEDINGUNGEN
.
108
3.19.3
POLYMERASE
UND
REAKTIONSANSAETZE
.
109
3.19.4
PCR-MATRIZE
.
109
3.20
STATISTISCHE
AUSWERTUNG
DER
EPIDEMIOLOGISCHEN
UNTERSUCHUNG
.
109
4
ERGEBNISSE.!!!
4.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
KLONIERTEN
PCR-PRODUKTE
.111
4.1.1
SEQUENZIDENTITAETSVERGLEICH
INNERHALB
EINES
EXEMPLARS
.
112
4.1.1.1
INTRA
UND
INTERSPEZIFISCHER
SEQUENZIDENTITAETSVERGLEICH
DES
ERSTEN
AMPLIFIKATS
.
115
4.1.2
VERGLEICH
MIT
SEQUENZEN
IN
DER
EMBL-DATENBANK
.
127
4.2
CHARAKTERISIERUNG
DES
REPETITIVEN
SEGMENTES
.
127
4.3
POLYMERASENTEST
IN
DER
PCR
.
128
4.4
SPEZIFITAET
DER
PCR
.
129
4.5
SENSITIVITAET
DER
PCR
.
130
4.6
SPEZIFITAET
DER
FASCIOLA
SPEZIFISCHEN
DNA-SONDE
.
132
4.7
SENSITIVITAET
DER
FASCIOLA
SPEZIFISCHEN
DNA-SONDE
.
133
4.8
REPRODUZIERBARKEIT
DER
SONDENHYBRIDISIERUNG
.141
4.9
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
DER
AUS
FARCIOFA-ENTWICKLUNGSSTADIEN
ISOLIERTEN
DNA
.
142
4.10
DNA-EXTRAKTIONSMETHODEN
VERGLEICH
BEI
DER
UNTERSUCHUNG
VON
ZWISCHENWIRTEN
VON
F.
HEPATICA
.
142
4.11
POSITIVE
VERSUCHSBESTAENDE
UND
STANDORTAUSWAHL
.
143
4.12
SCHNECKENSAMMLUNG
UND
AUFBEREITUNG
DER
PROBEN
.
146
4.13
EPIDEMIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ANHAND
DER
UNTERSUCHUNG
DES
ZWISCHENWIRTS
VON
F.
HEPATICA
.
147
4.13.1
KLIMATISCHE
DATEN
.
147
4.13.2
ERGEBNISSE
DER
ZWISCHENWIRTUNTERSUCHUNG
MIT
DER
FASCIOLA
SPEZIFISCHEN
DNA-SONDE
.
152
5
DISKUSSION.
164
5.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
SONDE
.
164
5.2
METHODENVERGLEICH
VON
DNA-EXTRAKTION
UND
HYBRIDISIERUNGSDETEKTION
.
169
5.3
EPIDEMIOLOGISCHE
AUSWERTUNG
.
173
6
ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY
.
184
7
LITERATURVERZEICHNIS
.
188
8
ANHANG.
225
8.1
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
225
8.2
MEDIEN
UND
PLATTEN
.
225
8.3
REAGENTIEN,
ENZYME,
REAKTIONSGEFAESSE,
REAKTIONSKITS
UND
GERAETE
.
226
8.4
ABBILDUNGEN
.
229
8.5
ABBILDUNGS
UND
TABELLENVERZEICHNIS
.
235
8.6
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
237
D
ANKSAGUN
G |
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