Molekulare Wirkmechanismen von antiestrogenen und estrogenrezeptor-affinen Platin(II)-Verbindungen:
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INHALTSVERZEICHNIS
LISTE
DER
VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN
.
XVII
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
TRANSKRIPTION
3
1.1.1
BASALE
TRANSKRIPTION
3
DER
EUKARYOTISCHE
PROMOTOR
3
ININANONSFAKTOREN
4
TFIID
8
TBP
IN
KLASSE
I
UND
III
TRANSKRIPTIONEN
11
1.1.2
TRANSKRIPTIONSREGULIERUNG
13
'UPSTREAM
PROMOTOR
ELEMENTS'
13
ENHANCER
14
"WIRKMECHANISMEN
VON
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
15
DIMERISIERUNG
VON
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
19
TRANSKRIPTIONELLE
UEBERLAGERUNG
BEI
DER
REGULATION
KOMPLEXER
PROMOTOREN
22
1.1.3
EINFLUSS
DER
CHROMATINSTRUKTUR
AUF
DIE
TRANSKRIPTION
24
BILDUNG
VON
TRANSKRIPTIONS-INITIATIONS-KOMPLEXEN
IM
CHROMATIN
24
AKTIVATOR-BINDUNG
AN
ERIHANCER-ELEMENTE
IM
CHROMATIN
25
DIE
ENTFALTUNG
HOCHGEORDNETER,
CHROMOSOMALER
STRUKTUREN
27
1.2
STEROIDHORMON-REZEPTOREN
29
1.2.1
DIE
KEM-REZEPTOR-FAMILIE
29
REZEPTOR-LOKALISATION
32
1.2.2
MECHANISMEN
DER
STEROIDHORMON-REZEPTOR-FUNKTIONEN
UNTER
BESONDERER
BERUECKSICHTIGUNG
DES
ESTROGEN-REZEPTORS
34
DIE
DNA-BINDENDE
DOMAENE
34
REZEPTOR-DIMERISIERUNG
UND
DNA-ERKENNUNG
37
DIE
HORMON-BINDENDE
DOMAENE
39
WECHSELWIRKUNGEN
ZWISCHEN
KEM-REZEPTOREN
UND
HITZESCHOCKPROTEINEN
39
EFFEKTE
DER
LIGANDBILDUNG
41
KEM-LOKALISATIONS-SIGNALE
44
SYNERGISMEN
ZWISCHEN
MEHRFACHEN
ESTROGEN-RESPONSE
ELEMENTEN
UND
BINDUNGSSTELLEN
ANDERER
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
44
TRANSKRIPTIONS-AKTIVIERUNGS-FUNKTIONEN
46
1.2.3
WIRKMECHANISMEN
VON
STEROIDHORMON-ANTAGONISTEN
AM
BEISPIEL
DER
ANTIESTROGENE
48
1.3
MOLEKULARE
WIRKMECHANISMEN
VON
PLATINKOMPLEXEN
IN
DER
TUMORTBERAPIE
53
1.3.1
ALLGEMEINE
WIRKMECHANISMEN
54
1.3.2
ESTROGEN-REZEPTOR-AFFINE
PLATINVERBINDUNGEN
63
1.4
ZIELSETZUNGEN
DER
VORLIEGENDEN
ARBEIT
65
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
68
2.1
VERWENDETE
MATERIALIEN
UND
GERAETE
68
2.1.1
MATERIALIEN,
ALLGEMEIN
68
2.1.2
PLATINKOMPLEXE
70
2.1.3
ESTROGENE
UND
ANTIESTROGENE
70
2.1.4
VEKTOREN
71
2.1.4.1
REPORTER-PLASMIDE
71
2.1.4.2
ESTROGENREZEPTOR-EXPRESSIONSVEKTOREN
73
2.1.5
ZELLINIEN
UND
BAKTERIENSTAEMME
75
2.1.6
PUFFERLOESUNGEN
76
2.2
METHODEN
UND
GERAETE
80
2.2.1
BINDUNGSEXPERIMENTE
AN
ESTROGENREZEPTOR
AUS
SCHWEINEUTERI
80
KOMPETITIONSEXPERIMENTE
81
DISSOZIATIONSKINETIKEN
82
DCC-METHODE
82
AGAR-GELELEKTROPHORESE
83
MIKROSOMENISOLATION
84
HERSTELLUNG
DES
MIKROSOMALEN
EXTRAKTES
85
2.2.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
ARBEITSMETHODEN
85
ANZUCHT
UND
KULTIVIERUNG
VON
BAKTERIENKULTUREN
85
TRANSFORMATION
VON
ESCHERICHIA
COLI
86
RESTRIKTIONSSPALTUNG
86
DEPHOSPHORYLIERUNG
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
87
ENZYMINAKTIVIERUNG:
PROTEINASE
K,
PHENOLEXTRAKTION
87
LIGATION
87
PLASMID-DNA
MINIPRAEPARATION
88
PLASMID-DNA
MAXIPRAEPARATION
88
DNA-KONZENTRATIONS
UND
REINHEITSBESTIMMUNG
89
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
90
DNA-EXTRAKTION
AUS
AGAROSEGELEN
91
2.2.3
ALLGEMEINE
BIOCHEMISCHE
ARBEITSMETHODEN
91
PROTEIN-BESTIMMUNG
91
SDS-POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE
92
NATIV-POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE
93
FIXIEREN
UND
TROCKNEN
VON
POLYACRYLAMID-GELEN
94
AUTORADIOGRAPHIE
94
2.2.4
ZELLKULTUR
UND
TRANSFEKTIONSEXPERIMENTE
94
KOHLE/DEXTRAN-BEHANDLUNG
VON
FOETALEM
KAELBERSERUM
95
EINFRIEREN
VON
ZELLEN
95
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
96
2.2.4.1
ZELLKULURBEDINGUNGEN
FUER
VERSCHIEDENE
ZELLINIEN
96
MCF-7
96
MDA-MB
23
I
97
HELA
97
CEF
98
2.2.4.2
TRANSFEKTIONEN
99
VORBEREITUNG
DER
ZELLEN
FOER
DIE
TRANSFEKTION
99
TRANSFEKTION
99
GLYCERIN-SCHOCK
100
ZELLERNTE
UND
ZELTYSE
100
2.2.4.3
CHARAKTERISIERUNG
VERSCHIEDENER
REPORTERSYSTEME
101
EREWTC:
CAT-REPORTERSYSTEM
101
EREWTC
LUC:
LUZIFERASE-REPORTERSYSTEM
103
PCHHO:
SS-GALAKTOSIDASE-REPORTERSYSTEM
106
2.2.5
NACHWEISMETHODEN
FUER
REPORTERGENE
108
2.2.5.1
CHLORAMPHENICOL-ACETYL-TRANSFERASE
108
2.2.5.2
SS-GALAKTOSIDASE
110
2.2.5.3
LUZIFERASE
111
LUZIFERASE-ASSAY
112
2.2.6
IN
VIRRO-EXPRESSION
VON
ESTROGEN-REZEPTOR
113
2.2.6.1
IN
VITRO-TRANSKRIPTION
114
2.2.6.2
IN
VITRO-TRANSLATION
115
KANINCHEN-RETIKULOZYTEN-LYSAT
115
WEIZEN-KEIM-EXTRAKT
116
2.2.7
GEL-SHIFT-ASSAY
119
2.2.8
CHARAKTERISIERUNG
DES
GEL-SHIFT-ASSAY-SVSTEMS
120
2.2.9
DICHTEGRADIENTEN-ZENTRIFAGATION
124
EICHUNG
DER
S-WERTE
125
3
ERGEBNISSE!
.
127
DER
PLATINKOMPLEX
MERO-RI.2-BIS('2.6-DICHLORO-4
HVDROXVPHENVLLETHVLENDIAMINLDIAQUAPLATINFIN-SULFAT
3.1
EINFLUSS
AUF
DAS
DNA-BINDUNGSVERHALTEN
DES
ESTROGEN-REZEPTORS
127
3.2
EINFLUSS
AUF
DIE
TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET
EINES
ESTROGENABHAENGIGEN
REPORTERGENS
129
3.2.1
TRANSFEKTIONSEXPERIMENTE
MIT
MCF-7-ZELLEN
129
3.2.2
KOMPETITIONSVERSUCHE
MIT
17-SS-ESTRADIOL
131
3.2.3
DIE
KINETIK
DER
TRANSKRIPTIONSHEMMUNG
132
3.2.4
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
REPARATUR
VON
PLATIN(II)-DNA-LAESIONEN
IN
MCF-7-ZELLEN
134
IN
VITRO-PLATINIERUNG
VON
PA2(-331/-289)TK-CAT
8+
134
CAT-EXPRESSIONSKINETIKEN
VON
PLATINIERTEN
REPORTERPLASMIDEN
135
3.3
ESTROGEN-REZEPTOR-BINDUNG
AN
PLATINIERTE
OLIGONUKLEOTIDE
137
3.4
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
STABILITAET
DES
PLATINKOMPLEXES
UNTER
ZELLKULTURBEDINGUNGEN
144
PULSEXPERIMENTE
MIT
17-B-ESTRADIOL
UND
MESO-6/4
144
VERSUCHE
ZUR
STABILITAET
VON
[PT(H2O)2
(MESO-6/4)]SO4
UNTER
BEDINGUNGEN
DER
ZELLTRANSFEKTION
145
4
DISKUSSION
1
.
149
DER
PLATINKOMPLEX
MESO-11.2-BIS(2.6-DICHLORO-4
HVDROXVPHENVL)ETHVLENDIAMIN1DIAQUAPLATIN(ID-SULFAT
4.1
ESTROGENE
EIGENSCHAFTEN
149
4.2
TRANSKRIPTIONSHEMMUNG
UND
ERZEUGUNG
VON
DNA-LAESIONEN
153
4.3
ENTKOPPLUNG
VON
AKTIVIERUNG
UND
HEMMUNG
DER
TRANSKRIPTION
155
4.4
REPARATUR
VON
DNA-LAESIONEN
156
4.5
ABSCHLIESSENDE
BEMERKUNGEN
ZUM
WIRKMECHANISMUS
156
4.6
STABILITAET
IN
BIOLOGISCHEM
MILIEU
157
5
ERGEBNISSE
II
.
160
DAS
ANTIESTROGEN
ZK
119.010
5.1
MOLEKULARE
WECHSELWIRKUNGEN
VON
ESTRADIOL
UND
ANTIESTROGENEN
MIT
ESTROGENREZEPTOR
AUS
SCHWEINE-UTERI
160
5.2
EINFLUSS
VERSCHIEDENER ESTROGENREZEPTOR-MUTATIONEN
AUF
DAS
DNA-BINDUNGSVERHALTEN
DES
ER
163
5.2.1
ZEITABHAENGIGKEIT
165
5.2.2
ABHAENGIGKEIT
DER
STABILITAETEN
DES
LIGAND-ER/
32
P-OLIGO
KOMPLEXES
VON
DER
SALZKONZENTRATION
170
5.2.3
ENTWICKLUNG
EINES
"INVERSEN"
GEL-SHIFT-ASSAYS
172
5.3
EINFLUSS
AUF
DIE
TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET
EINES
ESTROGENABHAENGIGEN
REPORTERGENS
173
5.3.1
TRANSFEKTIONSEXPERIMENTE
MIT
DER
ESTROGENREZEPTOR-POSITIVEN
MCF-7-ZELLINIE
174
5.3.2
KOTRANSFEKTIONSEXPERIMENTE
MIT
ESTROGENREZEPTOR-NEGATIVEN
ZELLINIEN
177
KOTRANSFEKTIONSSTUDIEN
IN
DER
MDA-MB23R^ELLINIE
178
KOTRANSFEKTIONSSTUDIEN
IN
CEF-PRIMAERZELLKULTUREN
179
KOTRANSFEKTIONSSTUDIEN
IN
HELA-ZELLINIEN
181
AUSWIRKUNGEN
VON
ZK
119.010
AUF
TAF-1
UND
TAF-2
DES
HER
183
AUSWIRKUNGEN
VON
LI
9
AUF
TAF-1
UND
TAF-2
DES
HER
185
5.4
EINFLUSS
AUF
DIE
STABILITAET
VON
ESTROGENREZEPTOR
MULTIPROTEINKOMPLEXEN
187
5.4.1
AUSWIRKUNGEN
AUF
DIE
GESAMTSTRUKTUR
187
5.4.2
AUSWIRKUNGEN
AUF
DIE
ESTROGENREZEPTOR-WECHSELWIRKUNGEN
MIT
HITZESCHOCKPROTEINEN
190
6
DISKUSSION
II
.
191
ANTIESTROGENE
6.1
WECHSELWIRKUNGEN
MIT
DEM
MIKROSOMALEN
ESTROGENREZEPTOR
AUS
SCHWEINEUTERI
191
6.2
BEEINFLUSSUNG
DER
ESTROGENREZEPTOR-DNA-BINDUNG
193
6.3
EINFLUSS
AUF
DIE
TRANSKRIPTIONS-AKTIVIERUNGS-FUNKTIONEN
DES
ESTROGENREZEPTORS
194
6.4
EINFLUESSE
AUF
DIE
ZUSAMMENSETZUNG
UND
STABILITAET
DES
ESTROGENREZEPTOR-MULTIPROTEINKOMPLEXES
196
6.5
VERGLEICH
DER
VORLIEGENDEN ERGEBNISSE
MIT
IN
VIVO-BEFUNDEN
AUS
TIERVERSUCHEN
197
6.6
MODELLE
FUER
DEN
ANTAGONISMUS
ZWISCHEN
ANTIESTROGENEN
UND
ESTROGENEN
202
7
ZUSAMMENFASSUNG
.
205
S
LITERATURVERZEICHNIS
.
207 |
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