Klonierung, rekombinante Expression und Charakterisierung Kohlenhydrat-bindender Antikörper:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Göttingen
Sierke
2012
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| Ausgabe: | 1. Aufl. |
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| Beschreibung: | XII, 281 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG * * 1
1.1 POLYSIALINSAEURE 4
1.2 UNK 1 10
1.3 OLIGOMANNOSEN 13
1.4 LEWISX * 17
1.5 TN-ANTIGEN 22
1.6 TF-ANTIGEN 25
1.7 KOHLENHYDRAT-BINDENDE PROTEINE 27
1.7.1 ERKENNUNG VON KOHLENHYDRATEN DURCH D A S IMMUNSYSTEM 27
1.7.2 KOHLENHYDRAT-BINDENDE ANTIKOERPER U N D LEKTINE 28
1.7.3 S T R U K T U R VON ANTIKOERPERN U N D ABGELEITETEN FRAGMENTEN 31
1.8 ZIELSETZUNG : 37
2 MATERIAL UND M E T H O D E N 3 9
2.1 MATERIAL 39
2.1.1 BAKTERIENSTAEMME, PLASMIDE UND OLIGODESOXYNUKLEOTIDE 39
2.1.2 PROTEINE U N D PROTEIN-REAGENZIEN 42
2.1.3 NUKLEINSAEURE-REAGENZIEN U N D KITS 4 3
2.1.4 CHEMIKALIEN... : 4 3
2.1.5 G E R AE T E 44
2.1.6 VERBRAUCHSMATERIAL 44
2.1.7 PUFFER, MEDIEN U N D STAMMLOESUNGEN 45
2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 48
2.2.1 ISOLIERUNG VON R N A 48
2.2.2 REVERSE TRANSKRIPTION VON R N A 48
2.2.3 DNA-MODIFIZIERUNG M I T TERMINALER TRANSFERASE 48
2.2.4 P R AE P A R A T I V E AUFREINIGUNG VON D N A AUS LOESUNGEN 49
2.2.5 ANALYTISCHE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON D N A 49
2.2.6 P R AE P A R A T I V E AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 49
2.2.7 KONZENTRATIONS- U N D REINHEITSBESTIMMUNG VON DNA 50
2.2.8, SPALTUNG VON D N A M I T RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 50
2.2.9 LIGIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 50
I
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IMAGE 2
2.2.10 POLYMERASEKETTENREAKTION ZUR AMPLIFIZIERUNG VON D N A -
ABSCHNITTEN 50
T A Q POLYMERASE REAKTIONEN 51
PHUSION POLYMERASE REAKTIONEN 52
2.2.11 SEQUENZIERUNG DOPPELSTRAENGIGER D N A 5 3
2.2.12 KULTIVIERUNG VON ESCHERICHIA CO/I-STAEMMEN 5 3
2.2.13 HERSTELLUNG KOMPETENTER ESCHERICHIA COLI- ZELLEN 54
2.2.14 TRANSFORMATION VON E. COLI M I T PLASMID-DNA 54
2.2.15 MINI-PRAEPARATIONEN VON PLASMID-DNA A U S E. COLI K U L T U R E N
55 2.2.16 MAXI-PRAEPARATIONEN VON PLASMID-DNA A U S E. COLI K U L T U R E
N .... 55 2.3 P R O D U K T I O N REKOMBINANTER PROTEINE IN E. COLI 55
2.3.1 P R O D U K T I O N REKOMBINANTER PROTEINE IM SCHUETTELKOLBEN 55
2.3.2 P R O D U K T I O N REKOMBINANTER PROTEINE IM LABORFERMENTER 56
2.4 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 57
2.4.1 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 57
2.4.2 COOMASSIE-FAERBUNG VON GELEN 58
2.4.3 BESTIMMUNG VON PROTEINKONZENTRATIONEN NACH BRADFORD 58
2.4.4 KONZENTRIERUNG VON PROTEINEN 59
2.4.5 STREP-TAG II AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 59
2.5 ZELLKULTURTECHNIKEN..- 60
2.5.1 P R AE P A R A T I O N VON MAKROPHAGEN 60
2.5.2 KULTIVIERUNG VON HYBRIDOMAZELLEN 61
2.6 IMMUNCHEMISCHE M E T H O D E N 6 1
2.6.1 WESTERN BLOTTING 61
2.6.2 IMMUNZYTOMETRIE 62
2.7 OBERFLAECHEN-PLASMONEN-RESONANZ-ANALYSEN ( S P R ) 62
2.8 E N T W U R F EINES KRISTALLISATIONS-SCREENS FUER
ANTIKOERPER-FRAGMENTE 65
2.9 KRISTALLISATION NACH DER DAMPFDIFFUSIONSMETHODE 68
2.10 GRUNDLAGEN DER ROENTGENSTRUKTURANALYSE 70
2.10.1 DATENSAMMLUNG, AUSWERTUNG, REDUKTION U N D MOLEKULARER E R S A
T Z 72
2.10.2 VERFEINERUNG DES STRUKTURMODELLS 7 3
2.11 SOFTWARE 74
3 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 75
3.1 IDENTIFIKATION VON PRIMAERSEQUENZEN 76
3.1.1 DER POLYSIALINSAEURE-BINDENDE ANTIKOERPER MENB 80
3.1.2 DER H N K - L - B I N D E N D E ANTIKOERPER Z N L 2 8 3
3.1.3 DER OLIGOMANNOSE-BINDENDE ANTIKOERPER L3 85
3.1.4 DER LEWISX-BINDENDE ANTIKOERPER L5 8 8
3.1.5 DER T F - B I N D E N D E ANTIKOERPER 3C9 91
3.1.6 DER TN-BINDENDE ANTIKOERPER 5F4 95
I I
IMAGE 3
3.2 KLONIERUNGSSTRATEGIEN FUER FAB-, FV- U N D DIABODY-FRAGMENTE 99
3.2.1 KLONIERUNG VON FAB-FRAGMENTEN U N D OPTIMIERUNG DES AFFINI T AE T
S T A G S * . 99
3.2.2 KLONIERUNG VON FV-FRAGMENTEN 102
3.2.3 KLONIERUNG VON DIABODY-FRAGMENTEN 103
3.3 P R O D U K T I O N U N D AUFREINIGUNG DER ANTIKOERPER-FRAGMENTE..
104
3.3.1 ETABLIERUNG EINES FERMENTATIONSVERFAHRENS 104
AUSWAHL EINES EXPRESSIONSSTAMMES 104
AUSWAHL EINES EXPRESSIONSVEKTORSYSTEMS 105
ETABLIERUNG U N D DURCHFUEHRUNG EINES FERMENTATIONSVERFAH RENS R 105
ERGEBNISSE DER FERMENTATIONEN 106
BEWERTUNG DER FERMENTATIONEN 108
3.3.2 AUFREINIGUNG MITTELS STREP-TAG II AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 108
3.3.3 ZUSAMMENFASSUNG UND BEWERTUNG DER PRODUKTION U N D AUFREI NIGUNG
113
3.4 UNTERSUCHUNGEN Z U M BINDEVERMOEGEN DER REKOMBINANTEN
ANTIKOERPERFRAGMENTE 114
3.5 CHARAKTERISIERUNG VON PSA-BINDENDEN ANTIKOERPER-FRAGMENTEN 115 3.5.1
SPR-UNTERSUCHUNGEN M I T 735 DIABODY-FRAGMENTEN 115
3.5.2 IMMUNFAERBUNGEN M I T 735 FAB-FRAGMENTEN 119
3.5.3 KRISTALLISATION VON 735 ANTIKOERPER-FRAGMENTEN 120
3.5.4 ROENTGENSTRUKTURANALYSEN VON 735 FAB-FRAGMENTEN 127
D A T E N S A M M L U N G U N D REDUKTION 127
VERFEINERUNG U N D G UE T E DES MODELLS 129
S T R U K T U R DES 735 FAB-FRAGMENTS IM KOMPLEX M I T
( N T H ) T D P Y I Y P I D 129
KONFORMATION DES PEPTIDS T D P Y I Y P I D 133
WECHSELWIRKUNGEN VON T D P Y I Y P I D 135
VERGLEICH DER STRUKTUREN DES HUMANEN U N D DES MURINEN 735 FAB-FRAGMENTS
138
ABSCHLIESSENDE BEMERKUNGEN ZUR S T R U K T U R DES 735 FABFRAGMERITS IM
KOMPLEX M I T D E M P E P T I D 141
3.6 CHARAKTERISIERUNG VON TN-ANTIGEN-BINDENDEN ANTIKOERPER-FRAGMENTEN .
143 3.6.1 SPR-UNTERSUCHUNGEN M I T 5F4 FAB-FRAGMENTEN 143
BEWERTUNG DER SPR-UNTERSUCHUNGEN M I T 5F4 FAB-
FRAGMENTEN 149
3.6.2 KRISTALLISATION VON 5F4 FAB-FRAGMENTEN 150
3.6.3 ROENTGENSTRUKTURANALYSEN VON 5F4 FAB-FRAGMENTEN 152
DATENSAMMLUNG U N D REDUKTION 152
VERFEINERUNG UND G UE T E DER MODELLE 156
KRISTALLSTRUKTUREN VON 5F4 FAB-FRAGMENTEN 160
DOCKING VON GALNAC-O-SERIN 164
I I I
IMAGE 4
3.7 CHARAKTERISIERUNG VON TF^ANTIGEN-BINDENDEN ANTIKOERPER-
FRAGMENTEN * 171
3.7.1 SPR-BINDUNGSSTUDIEN DES ANTIKOERPERS 3C9 M I T D E M T F -
ANTIGEN 171
3.7.2 KRISTALLISATION VON 3C9 FAB-FRAGMENTEN 173
3.8 CHARAKTERISIERUNG VON LEWISX-BINDENDEN ANTIKOERPER-FRAGMENTEN 176
3.8.1 SPR-UNTERSUCHUNGEN M I T L5 FAB-FRAGMENTEN 176
3.8.2 BEWERTUNG DER SPR-UNTERSUCHUNGEN U N D AUSBLICK 181
3.8.3 KRISTALLISATION VON L5 FAB-FRAGMENTEN 182
3.9 CHARAKTERISIERUNG VON H N K - L - B I N D E N D E N
ANTIKOERPER-FRAGMENTEN 184 3.9.1 SPR-BINDUNGSSTUDIEN M I T Z N L 2
FAB-FRAGMENTEN 184
3.9.2 ROENTGENSTRUKTURANALYSEN VON Z N L 2 FAB-FRAGMENTEN 188
KRISTALLISATION VON Z N L 2 FAB-FRAGMENTEN 188
D A T E N S A M M L U N G U N D REDUKTION 190
STRUKTURLOESUNG, VERFEINERUNG U N D G UE T E DES MODELLS 193
S T R U K T U R DER ANTIGENBINDESTELLE VON Z N L 2 197
3.10 CHARAKTERISIERUNG VON OLIGOMANNOSE-BINDENDEN ANTIKOERPERFRAGMENTEN
200
3.10.1 BIOCHEMISCHE VERSUCHE ZUR B I N D U N G VON L3 FAB- U N D
FVFRAGMENTEN 200
3.10.2 SPR-UNTERSUCHUNGEN M I T L3 FAB-FRAGMENTEN 201
3.10.3 ROENTGENSTRUKTURANALYSEN M I T L3 FV-FRAGMENTEN 206
KRISTALLISATION VON L3 FV-FRAGMENTEN 206
D A T E N S A M M L U N G U N D REDUKTION VON L3 FV-FRAGMENTEN 207
VERFEINERUNG U N D G UE T E DES MODELLS 209
S T R U K T U R EINES VL-DIMERS DES ANTIKOERPERS L 3 210
BEWERTUNG DER KRISTALLISATION VON FV-FRAGMENTEN 213
4 ZUSAMMENFASSUNG.! 217
5 SUMMARY..: 2 2 1
A N H A N G 2 2 5
A . L ABKUERZUNGEN 226
A.2 ZUSAETZLICHE ABBILDUNGEN 228
A.3 NUKLEOTID-SEQUENZEN 230
A.4 GEFAHRSYMBOLE, RISIKO- U N D SICHERHEITSSAETZE 243
LITERATUR 2 4 7
I V
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