Entwicklung eines regenerierbaren Mikroarray-Chips zur simultanen Detektion von 13 Antibiotika in Milch:
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2009
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| adam_text | Titel: Entwicklung eines regenerierbaren Mikroarray-Chips zur simultanen Detektion von 13 Antibiotika in Mi
Autor: Kloth, Katrin
Jahr: 2009
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis..........................................................................................1
Vorwort....................................................................................................................3
1 Einleitung und Problemstellung.....................................................................5
2 Theoretische Grundlagen................................................................................9
2.1 Antibiotika.............................................................................................................................9
2.1.1 Charakterisierung und Klassifizierung der Antibiotika.....................................................9
2.1.1.1 Sulfonamide............................................................................................................................9
2.1.1.2 ß-Laktame.............................................................................................................................10
2.1.1.3 Aminoglykoside.....................................................................................................................12
2.1.1.4 Polyketide..............................................................................................................................13
2.1.1.5 Chinolone..............................................................................................................................15
2.1.2 Einsatz von Antibiotika in der Veterinärmedizin............................................................16
2.2 Analytik von Antibiotika-Rückständen in Milch..............................................................22
2.2.1 Stand der Technik..........................................................................................................22
2.2.1.1 Anforderungen an die Analytik..............................................................................................22
2.2.1.2 Mikrobiologische Hemmstofflests..........................................................................................22
2.2.1.2.1 Prinzip der mikrobiologischen Hemmstofftests..............................................................22
2.2.1.2.2 Brillantschwarz-Reduktionstest.....................................................................................23
2.2.1.3 Physikalisch-chemische Nachweisverfahren.........................................................................24
2.2.1.4 Immunologische Vorgehensweisen.......................................................................................26
2.2.1.4.1 Prinzip des Enzym-Immunoassays................................................................................27
2.2.1.4.2 Kommerzielle Rezeptor-Schnelltestsysteme.................................................................31
2.2.2 Einsatz der Mikroarray-Technologie..............................................................................33
2.2.2.1 Definition und Anwendung.....................................................................................................33
2.2.2.2 Herstellung und Modifizierung von Mikroarray-Chipoberflächen...........................................34
2.2.2.2.1 Oberflächenchemie.......................................................................................................34
2.2.2.2.2 Immobilisierung.............................................................................................................37
2.2.2.3 Detektion von Mikroarrays.....................................................................................................39
2.2.2.4 Prinzip des Chemilumineszenz-Mikroarray-Immunoassays..................................................41
2.2.2.5 Nachweisverfahren mittels Biosensortechnik........................................................................43
3 Beschreibung und Diskussion der Ergebnisse...........................................47
3.1 Oberflächenchemie für Hapten-Mikroarrays...................................................................47
3.1.1 Verwendung und Herstellung von PEG-Oberflächen....................................................47
3.1.2 Charakterisierung der DAPEG-Oberflächen..................................................................49
3.2 Aufbau der Antibiotika-Mikroarrays.................................................................................54
3.2.1 Optimierung der DAPEG-Beschichtung zur Immobilisierung von Antibiotika................54
3.2.1.1 Aktivierung der Haptene für die Kopplung an die DAPEG-Oberfläche..................................54
3.2.1.2 Herstellung der unterschiedlich aktivierten DAPEG-Oberflächen..........................................56
3.2.1.2.1 Modifikation der DAPEG-Oberflächen...........................................................................57
3.2.1.2.2 Immobilisierung von SMA auf die modifizierten DAPEG-Oberflächen...........................59
3.2.1.2.3 Kopplung der 13 Antibiotika-Derivate auf die Epoxy-PEG-Oberfläche..........................62
3.2.1.2.4 Verwendung einer Stem-PEG-Oberflächenbeschichtung.............................................65
3.2.2 Optimierung der Spotting-Bedingungen........................................................................67
3.2.2.1 Auswahl des Spotting-Puffers zur Immobilisierung der Antibiotika........................................67
3.2.2.2 Ermittlung der Antibiotika-Konzentration für die Immobilisierung..........................................69
3.2.3 Auswahl der Positiv- und Negativkontrolle....................................................................72
3.2.4 Optimierung der Inkubationsbedingungen.....................................................................74
3.2.4.1 Einstellung der Inkubationsdauer..........................................................................................74
3.2.4.2 Einstellung der Inkubationstemperatur..................................................................................75
3.2.5 Auswahl des Inaktivierungspuffers................................................................................78
3.2.6 Untersuchung der Regeneration....................................................................................79
3.2.7 Untersuchung der Stabilität der Antibiotika-Mikroarrays...............................................82
3.3 Validierung des CL-MIA auf den Antibiotika-Mikroarrays.............................................84
3.3.1 Bestimmung der Präzision.............................................................................................84
3.3.2 Untersuchung der Antikörperselektivitäten....................................................................85
3.3.3 Ermittlung der Wiederfindungsraten..............................................................................87
3.3.4 Aufnahme von Standardkalibrierkurven.........................................................................89
3.3.4.1 Vollmilch................................................................................................................................89
3.3.4.2 Rohmilch...............................................................................................................................90
3.3.5 Realprobenmessungen am MPR...................................................................................94
3.4 Aufbau des MCR 3.............................................................................................................96
3.4.1 Anforderungen an den MCR 3.......................................................................................96
3.4.2 Realisierung...................................................................................................................99
3.4.2.1 Design des MCR 3................................................................................................................99
3.4.2.2 Design der Mikroarray-Durchflusszelle................................................................................106
3.4.2.3 Zeitlicher Programmablauf der CL-MIA-Messungen...........................................................109
3.4.2.4 Vergleichbarkeit der beiden Messkanäle.............................................................................113
3.4.2.5 Kreuzkontamination.............................................................................................................116
4 Zusammenfassung und Ausblick...............................................................119
4.1 Kapitelübersicht...............................................................................................................119
4.2 Zusammenfassung..........................................................................................................119
4.3 Ausblick............................................................................................................................123
5 Experimenteller Teil.....................................................................................127
5.1 Verwendete Geräte und Materialien...............................................................................127
5.1.1 Standardgeräte und -materialien.................................................................................127
5.1.2 MCR 3-Auslesgerät und Zubehör................................................................................128
5.1.3 Kontaktspotter und Zubehör........................................................................................129
5.2 Software............................................................................................................................129
5.3 Chemikalien und Reagenzien.........................................................................................129
5.3.1 Chemikalien.................................................................................................................129
5.3.2 Antibiotika....................................................................................................................131
5.3.3 Verfügbare Antikörper..................................................................................................132
5.3.4 Kommerziell erhältliche Antikörper..............................................................................133
5.3.5 Immunochemische Reagenzien..................................................................................133
5.3.6 Puffer............................................................................................................................133
5.4 Standardprozeduren........................................................................................................135
5.4.1 Vorschriften zur Herstellung der Antibiotika-Mikroarrays............................................135
5.4.1.1 Herstellung der DAPEG-Chipoberflächen...........................................................................135
5.4.1.1.1 Vorbereitung................................................................................................................135
5.4.1.1.2 Reinigung....................................................................................................................135
5.4.1.1.3 Anätzung der Glasoberfläche......................................................................................135
5.4.1.1.4 Silanisierung................................................................................................................135
5.4.1.1.5 DAPEG-Beschichtung.................................................................................................136
5.4.1.2 Biotinylierung der DAPEG-Chipoberfläche..........................................................................136
5.4.1.2.1 Belegung der gesamten Chipoberfläche.....................................................................136
5.4.1.2.2 Immobilisierung mittels Kontaktspotter........................................................................136
5.4.1.3 Herstellung der NHS-PEG-Chipoberfläcnen........................................................................137
5.4.1.4 Herstellung der Amid-NHS-PEG-Chipoberflächen..............................................................137
5.4.1.5 Herstellung der Epoxy-PEG-Chipoberflächen.....................................................................137
5.4.1.6 Herstellung der Streptavidin-Chipoberflächen.....................................................................138
5.4.1.7 Herstellung der Star-PEG-Chipoberflächen.........................................................................138
5.4.1.8 NHS-Aktivierung von SMA..................................................................................................138
5.4.1.8.1 Einführung einer Säurefunktion mit Bernsteinsäureanhydrid.......................................138
5.4.1.8.2 Einführung eines Aktivesters mit NHS.........................................................................139
5.4.1.9 Biotinylierung von SMA.......................................................................................................139
5.4.1.10 Antibiotika-Immobilisierung..................................................................................................140
5.4.1.11 Inaktivierung der Hapten-Mikroarray-Chipoberfläche..........................................................141
5.4.1.12 Fertigung der Mikroarray-Durehnusszelle............................................................................142
5.4.2 CL-MIA-Messungen.....................................................................................................142
5.4.2.1 Kalibrier-und Probenmessungen........................................................................................142
5.4.2.2 Ermittlung von Kreuzreaktivitäten........................................................................................143
5.4.2.3 Bestimmung von Wiederfindungsraten................................................................................144
5.4.2.4 Untersuchung der DAPEG-Oberflächenbeschaffenheit......................................................144
5.4.2.5 Kreuzkontamination.............................................................................................................144
5.4.3 Datenauswertung.........................................................................................................145
Literaturverzeichnis.....................................................................................147
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