Funktionelle Charakterisierung der Kationenkanäle TRPM3 und Melastatin (TRPM1):
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2012
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INHALT
1 EINLEITUNG 1
1.1 CALCIUM-EINTRITT-MECHANISMEN 1
1.2 TRP-KANALFAMILIE 2
1.3 TRPC-KANAL-UNTERFAMILIE 5
1.4 TRPV-KANAL-UNTERFAMILIE 6
1.5 TRPM-FAMILIE 8
1.6 TRP-KANAL MODULIERENDE SUBSTANZEN 12
1.7 FUNKTIONELLE ROLLE VON MELANOZYTEN 13
1.8 INSULINSEKRETION UND TRP-KANAELE .15
1.9 ZIELSETZUNG 17
2 MATERIALIEN UND GERAETE 18
2.1 MATERIALIEN FUER DIE ZELLKULTUR 18
2.1.1 EUKARYONTISCHE ZELLLINIEN 18
2.1.2 BAKTERIENSTAEMME 18
2.1.3 MEDIEN UND MEDIENZUSAETZE 19
2.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN 19
2.3 ENZYME 20
2.4 MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS FUER PROTEINE UND DNA 20
2.5 ANTIKOERPER 21
2.5.1 PRIMAERANTIKOERPER 21
2.5.2 SEKUNDAERANTIKOERPER 21
2.5.3 CDNAS UND OLIGONUKLEOTIDE 22
2.6 CHEMIKALIEN 23
2.6.1 ALLGEMEIN 23
2.6.2 REAKTIONSKITS 24
2.7 GERAETE 24
2.7.1 BAKTERIEN UND ZELLKULTUR 24
2.7.2 CALCIUM-IMAGING UND FRET-ANALYSE 25
2.7.3 ZENTRIFUGEN 25
2.7.4 ELEKTROPHORESE UND WESTERN BLOT 25
2.7.5 SONSTIGE GERAETE 25
2.7.6 ZUR DATENANALYSE UND DOKUMENTATION VERWENDETE SOFTWARE 26
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IMAGE 2
3 METHODEN 27
3.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 27
3.1.1 ZELLKULTUR 27
3.1.2 KULTIVIERUNG VON ZELLLINIEN UND PRIMAERZELLEN 27
3.1.3 PASSAGIEREN VON HEK293 ZELLEN FUER TRANSFEKTIONEN 28
3.1.4 TRANSIENTE TRANSFEKTION EUKARYONTISCHER ZELLEN 29
3.1.5 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN 29
3.1.6 HERSTELLUNG VON GESAMTZELL-LYSATEN AUS KULTURZELLEN 30
3.1.7 HERSTELLUNG VON GESAMTZELL-LYSATEN AUS PANKREATISCHEN SS-ZELLEN 30
3.1.8 PRAEPARATION VON MEMBRANPROTEINEN AUS KULTURZELLEN 31
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 31
3.2.1 VERFAHREN ZUR GERICHTETEN MUTAGENESE 31
3.2.2 RNA-ISOLIERUNG UND RT-PCR 32
3.2.3 AUFTRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN MITTELS AGAROSEGELELEKTROPHORESE 34
3.2.4 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 34
3.2.5 TRANSFORMATION IN KOMPETENTE E. COLI ZELLEN 35
3.2.6 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 35
3.2.7 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PLASMID-DNA UND TOTAL-RNA 36
3.3 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 37
3.3.1 KOLORIMETRISCHER NACHWEIS VON PROTEINEN: BICINCHONINSAEURE (BCA)
-ASSAY .. 37
3.3.2 SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE 37
3.3.3 TANK-BLOT-TRANSFER VON PROTEINEN A U F NITROCELLULOSEMEMBRANEN 38
3.3.4 FAERBUNG VON NITROCELLULOSEMEMBRANEN MIT PONCEAU S 38
3.3.5 IMMUNCHEMISCHER NACHWEIS VON IMMOBILISIERTEN PROTEINEN 39
3.4 IMAGING-T ECHNIKEN 40
3.4.1 FLUORESZENZ IMAGING PLATE READER (FLIPR) ASSAY 40
3.4.2 FLUOROMETRISCHE MESSUNG DER INTRAZELLULAEREN CALCIUMKONZENTRATION
42
3.4.3 FLUORESZENZ-RESONANZ-ENERGIETRANSFER (FRET) 44
3.4.4 KONFOKALE LASER-SCANNING-MIKROSKOPIE 46
3.4.5 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ AN PARAFFINSCHNITTEN 47
3.5 TIEREXPERIMENTELLES ARBEITEN 48
3.5.1 TIERHALTUNG 48
3.5.2 TIERZUCHT 48
3.5.3 GENOTYPISIERUNG DER TRPM3- UND TRPML-AETW?C&O/-MAEUSE 49
IMAGE 3
3.5.4 ISOLATION VON PANKREATISCHEN SS-ZELLEN AUS MAUS 49
3.5.5 EXTRAKTION VON PROTEINEN AUS ORGANEN 50
3.5.6 HERSTELLUNG VON PARAFFINSCHNITTEN FIXIERTER GEWEBE FUER DIE LICHT-
UND KONFOKALE
LASER-SCANNING-MIKROSKOPIE 50
3.5.7 HAEMATOXILIN-EOSIN (HE) -FAERBUNG VON PANKREASGEWEBE 51
4 ERGEBNISSE 53
4.1 CHARAKTERISIERUNG VON TRPM1 IN MELANOZYTEN 53
4.1.1 NACHWEIS DER PROTEINEXPRESSION VON TPRM1 IN MELANOZYTEN 53
4.1.2 EINFLUSS EINER MELANINUEBEREXPRESSION A U F DIE KANALPROTEINE TRPM1
UND
TRPM2 IN MELANOZYTEN-ZELLLINIEN 1 54
4.1.3 WIRKUNG VON LPS A U F TRPM1 UND TRPM2 IN MELANOZYTEN 58
4.2 CHARAKTERISIERUNG VON TRPM1 -KNOCKOUT- UND
TRPM3-ATOC^OW/-MAUSLINIEN 61
4.2.1 GENOTYPISIERUNG MITTELS PCR-REAKTION 61
4.2.2 ANALYSE EINER TRPM1 -KNOCKOUT- SOWIE EINER
TRPM3-ATOC^OW?-MAUSLINIE
MITTELS WESTERN BLOT 63
4.2.3 ANALYSE DER TRPM1- SOWIE TRPM3-EXPRESSION IN LANGERHANS-INSELN
MITTELS
WESTERN BLOT 65
4.2.4 NACHWEIS VON TRPM3 IN INSULIN-SEZERNIERENDEN SS-ZELLEN MITTELS
INDIREKTER
IMMUNFLUORESZENZ 67
4.2.5 CHARAKTERISIERUNG EINER TRPM3-AETNOCAE:O/-MAUSLINIE MITTELS REVERSE
TRANSKRIPTASE-PCR (RT-PCR) 70
4.2.6 SEQUENZANALYSE DER DURCH RT-PCR ERHALTENEN AMPLIFIKATE VON TRPM3
71
4.3 GENERIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER TRPM3-DELETIONSMUTANTE IM
HETEROLOGEN EXPRESSIONSSYSTEM 72
4.3.1 SUBZELLULAERE LOKALISATION UND VERTEILUNG VON TRPM3-WILDTYP UND
TRPM3DELETIONSMUTANTE 73
4.3.2 BILDUNG VON HETEROMEREN ZWISCHEN TRPM3-WILDTYP UND
-DELETIONSMUTANTE 74
4.3.3 FUNKTIONELLE ANALYSE DER TRPM3-DELETIONSMUTANTE 76
4.4 IDENTIFIZIERUNG EINES SELEKTIVEN TRPM3-KANALBLOCKERS 77
4.4.1 BIOCHEMISCHE UND FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG VON
STABIL-TRP-KANALEXPRIMIERENDEN ZELLLINIEN ZUR IDENTIFIKATION EINES
SELEKTIVEN BLOCKERS 78
4.4.2 EFFEKTE VON FENAMATEN A U F TRPM3 UND ANDERE MITGLIEDER DER TRP-
KANALFAMILIE 80
IMAGE 4
4.4.3 CHARAKTERISIERUNG VON MEFENAMINSAEURE ALS SELEKTIVER
TRPM3-KANALBLOCKER MIT
HILFE DER FLUOROMETRISCHEN EINZELZELL-CALCIUM-MESSUNG 85
4.4.4 CHARAKTERISIERUNG VON MEFENAMINSAEURE ALS SELEKTIVEN
TRPM3-KANALBLOCKER
MIT HILFE VON GANZ-ZELL-AUFNAHMEN 86
4.4.5 PH-ABHAENGIGKEIT DER INHIBITION VON MEFENAMINSAEURE 88
4.4.6 EFFEKTE VON MEFENAMINSAEURE ALS SELEKTIVER TRPM3-BLOCKER AUF
INSULINSEZERNIERENDE ZELLEN 89
5 DISKUSSION 95
6 ZUSAMMENFASSUNG 107
7 SUMMARY 109
8 LITERATURVERZEICHNIS 111
9 PUBLIKATIONEN 128
10 LEBENSLAUF 129
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