Bakteriophagen für Acetobacter methanolicus: Risikofaktoren für technische Prozesse und Carrier für genetische Information
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Leipzig [u.a.]
UFZ
2000
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| adam_text | Titel: Bakteriophagen für Acetobacter methanolicus
Autor: Kiesel, Bärbel
Jahr: 2000
Verzeichnisse
Inhaltsverzeichnis Seite
1. Einleitung 1
2. Material und Methoden 11
2.1 Mikroorganismen 11
2.1.1 Übersicht über verwendete Bakterien 11
2.1.2 Kultivierung der Bakterien 13
2.1.2.1 Nährmedien 13
2.1.2.2 Kultivierung in FlUssigmedium 14
2.1.2.3 Kultivierung auf Festmedium 14
2.1.2.4 Bestimmung der Zelldichte 15
2.1.2.5 Stammhaltung 15
2.2 Bakteriophagen 15
2.2.1 Grundtechniken zum Arbeiten mit Phagen 15
2.2.1.1 Nachweis von Bakteriophagen 15
2.2.1.2 Isolierung, Anreicherung und Anlegen von reinen Phagenlinien 16
2.2.1.3 Ermittlung der Wirtsbereiche der Bakteriophagen 17
2.2.1.4 Bestimmung der Parameter der lyrischen Entwicklung 18
2.2.1.5 Gewinnung reiner Phagen-Suspensionen mit hohem Titer 1S
2.2.2 Charakterisierung kompletter Phagen 19
2.2.2.1 Serologische Untersuchungen 19
2.2.2.1.1 Gewinnung von Anti-Phagen-Seren 19
2.2.2.1.2 Reaktionen der Phagen mit Antiseren 19
2.2.2.2 Beständigkeit der Phagen gegen thermische und chemische Noxen 20
2.2.2.2.1 Thermische Inaktivierung freier Phagen 20
2.2.2.2.2 Abhängigkeit der Vitalität der Phagen vom pH-Wert des Mediums 20
2.2.2.2.3 Beständigkeit gegen Chloroform 20
2.2.2.2.4 Überlebensraten nach UV-Exposition 20
2.2.3 Charakterisierung der Phagenbansteine 21
2.23.1 Isolierung und Charakterisierung der DNA 21
2.2.3.1.1 Präparation 21
2.23.1.2 Restriktionsendonucleaseverdau und gelelektrophoretische Trennung 21
2.23.1.4 Southem-Transfer 23
Verzeichnisse
2.2.3.1.5 Nick-Translation und Hybridisierung 24
2.2.3.1.6 Elektronenmikroskopische Techniken 25
2.2.3.2 Analyse der PhagenhUllproteine 25
2.2.3.2.1 Gewinnung der Hüllproteine 25
2.2.3.2.2 Elektrophoretische Trennung der Proteine 25
2.2.3.2.3 Silberfärbung 26
2.2.3.2.4 Auswertung der Gele 26
2.3 Vergleichende Untersuchung von Acetobacter methanolicus -Stämmen 27
2.3.1 Präparation der chromosomalen DNA 27
2.3.2 Untersuchungen auf Homologie zwischen Phagen-und Bakterien-DNA 27
2.3.3 Untersuchung auf Lysogenie durch Induktion von Prophagen 28
2.3.3.1 Mikrobiologischer Induktionsnachweis 28
2.3.3.2 Elektronenmikroskopische Darstellung induzierter Partikel 28
2.4 Gentransfer bei A. methanolicus 28
2.4.1 Transduktion am System A. methanolicus MB58/4-Phage Acml 28
2.4.1.1 Auswahl der Rezipientenstämme 28
2.4.1.2 Transduktionsexperimente 29
2.4.1.3 Optimierung der Transduktion 30
2.4.1.4 Stabilitätsuntersuchungen an Transduktantenklonen 31
2.4.1.5 Transduktionsuntersuchungen für weitere Auxotrophiemarker 31
2.4.2 Transfektion 31
2.4.2.1 Erzeugung von Sphäroplasten und deren Regeneration 31
2.4.2.2 Gewinnung der DNA zur Transfektion 32
2.4.2.3 Methode der Transfektion 32
2.4.2.4 Isolierung transfektiv vermehrter Phagen (TAczn-Phagen) 33
2.4.2.5 Überprüfung der Wirtsbereiche 33
2.4.2.6 vergleichende Restriktionsuntersuchungen der DNA der Acm-
und TAcm-Phagen 33
2.5 Verwendete Medien und Lösungen 34
2.5.1 Medien 34
2.5.2 Puffer und Lösungen 35
2.5.3 Enzyme 38
3. Ergebnisse 39
3.1 Isolierung und Charakterisierung von Phagen für A. methanolicus 39
Verzeichnisse
3.1.1 Nachweis, Isolierung und Benennung von Phagen 39
3.1.2 Wirtsbereiche der Acm-Phagen 45
3.1.3 Parameter der lyrischen Entwicklung der Acm-Phagen 46
3.1.4 Morphologie und Sensitivität gegen Umweltfaktoren SO
3.1.4.1 Ultrastruktur der Phagen 50
3.1.4.2 Neutralisation mit Anti-Phagen-Seren 54
3.1.4.3 Stabilität gegen physikalische und chemische Noxen 56
3.1.4.3.1 Thermische Inaktivierung freier Phagen 56
3.1.4.3.2 pH-Toleranz freier Phagen 57
3.1.4.3.3 Beständigkeit gegen Chloroform 59
3.1.4.4 Zusammenfassung 60
3.1.5 Bestandteile der Bakteriophagen 61
3.1.5.1 Hüllproteine 61
3.1.5.2 Nukleinsäuren 65
3.1.5.2.1 Molekulargewichte der Restriktionsfragmente nach Restriktionsspaltung 65
3.1.5.2.2 Genomgröße 72
3.1.5.2.3 Homologien zwischen den Nukleinsäuren der Acm-Phagen 77
3.1.5.3 Zusammenfassung 79
3.2 Lysogenie bei Acetobacter methanolicus 80
3.2.1 Mikrobiologischer Nachweis induzierter Phagen 80
3.2.2 Elektronenmikroskopischer Nachweis von Phagenpartikem 80
3.2.3 Homologie zwischen Phagen-DNA und Chromosomen 87
3.2.4 Zusammenfassung 89
3.3 Gentransfer im System Acetobacter methanolicus/ Acm-Phagen 89
3.3.1 Transduktion 89
3.3.1.1 Auswahl geeigneter Rezipientenstämme 89
3.3.1.2 Transduktion nach Standardprozedur 90
3.3.1.3 Optimierung der Transduktion mit dem Rezipientenstamm MB 58/4-101 90
3.3.1.3.1 Einfluß von UV-licht 90
3.3.1.3.2 Erhöhung der Effektivität durch Verringerung von Sekundärinfektionen 93
3.3.1.3.3 Einfluß der Wachstumsphase des Rezipienten auf die Höhe der EOT 94
3.3.1.4 Stabilitätsuntersuchungen an den Transduktanten 95
3.3.1.5 Transduktion weiterer Marker mit dem optimierten Transduktionssystem 96
3.3.1.6 Zusammenfassung 96
3.3.2 Transfektion für das System A. methanolicus und seine Phagen 98
Verzeichnisse_________________________________IV
3.3.2.1 Nachweis der Transfektion 98
3.3.2.2 Charakterisierung der durch Transfektion gewonnenen Phagen 99
3.3.2.3 Vergleich von Acm- und TAcm-Phagen 99
3.3.2.4 Zusammenfassung 101
4. Diskussion
4.1 Phagen für A. methanolicus 102
4.1.1 Vergleich der Acm-Phagen mit Phagen anderer methylotropher sowie
acidophiler Bakterien 102
4.1.2 Acm-Phagen - eine neue Phagen-Art? 103
4.1.3 Acm-Phagen - verschiedene Stämme einer Phagen-Art? 104
4.2 Lysogenie in Stämmen der Art A methanolicus 109
4.3 Gentransfer mit Acm-Phagen 112
4.3.1 Transfektion 112
4.3..2 Transduktion 114
5. 7.nsamnwnfagaing 117
6. Literatur 120
Verzeichnisse ________________________________V___________________________________________
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Elektronenmikroskopischer Erstnachweis von Bakteriophagen aus Fermentationen mit dem Stamm
Acetobacur methanolicus MBS8
Abbildung 2: Plaques des Phagen Acml auf seinem Wirtsstamm A. methanolicus MB58/4
Abbildung 3: Plaques des Phagen AcmS auf seinem Wülsstamm A. methanolicus MB70
Abbildung 4: Plaques des Phagen Acm6 auf dem Wirtsstamm A. methanolicus MB70
Abbildung 5: Plaques des Phagen Acm6 auf dem Wirtsstamm A methanolicus MB 129
Abbildung 6: Plaques des Phagen Acm7 auf seinem Wirtsstamm A. methanolicus MB 129
Abbildung 7: Plaques des Phagen Acm2 auf seinem Win A. methanolicus MB58/10
Abbildung 8: Einstufenwachstumsexperimente mit dem Phagen Acml auf A methanolicus MB58/4
Abbildung 9: Einstufenwachstumsexperiment mit dem Phagen Acm2 auf A methanolicus MB58/10
Abbildung 10: Einstufenwachstumsexperimente mit dem Phagen AcmS auf A. methanolicus MB70
Abbildung 11: Einstufenwachstumsexperimente mit dem Phagen Acm6 auf A. methanolicus MB 129
Abbildung 12: Einstufenwachstumsexperimente mit dem Phagen Acm7 auf A. methanolicus MB 129
Abbildung 13: Hektronenmikroskopische Darstellung des Phagen Acml
Abbildung 14: Elektronenmikroskopische Darstellung des Phagen Acm2
Abbildung IS: Elektronenmikroskopische Darstellung des Phagen AcmS
Abbildung 16: Elektronenmikroskopische Darstellung des Phagen Acm6
Abbildung 17: Etektronenmikroskopische Darstellung des Phagen Acm7
Abbildung 18: Übersicht über ultrastrukturelle Merkmale der Acm-Phagen
Abbildung 19: Inaktivierung der 5 Acm-Phagen über ein Temperaturintervall von 32°C bis 60 C
Verzeichnisse _______________________________VI_____________________________________
Abbildung 20: pH-Stabilität der Acm-Phagen nach 24 h Inkubation in Theorell-Stenhagen-Puffer unterschiedlicher
pH-Weite
Abbildung 21: Analyse der Phagenhaliproteine der Phagen Acml, Acm2, Acm5, Acm6 und Acm7 im PAA-
Gradientengel
Abbildung 22: Spaltung der Acm-DNA mit den Restriktionsendonucteasen HindlU, PstI und PvuB
Abbildung 23: Spaltung der Acm-DNA mit den Restriktionsendonucleasen Bgll und Said
Abbildung 24: Spaltung der Acm-DNA mit den Restriktionsendonucleasen EcoRL EcoRV und Clal
Abbildung 25: Spaltung von Acml-DNA mit den Restriktionsendonucleasen SalGI, PstI und PvuII
Abbildung 26: Lineares Acml-Genom und zirkuläre pBR322- DNA als Referenz nach Spreitung
Abbildung 27: Hotnoduplices von Acml-DNA mit einsträngigen Enden
Abbildung 28: Hybridiserungsmuster gespaltener DNA der 3 Acm-Phagen mit ^P-markierterAcml-DNA und
Acm6-DNA
Abbildung 29: Mit Mitomycin C induzierte Phagenpattikel aus A. methanolicus-SViiamcn
Abbildung 30a: Chromosomale DNA der A. methanolicus-SOnaac MB58, MB58/4, MB58/10, MB70, MB129,
MB55. MB56, MB60 und MB135; mit Hindin gespalten
Abbildung 30b: Homologien zwischen Acml-DNA und chromosomaler DNA der A. methanolicus-Sümnx aus Abb.
30a nach Hybridisierung mit DIG-markierter Acml-DNA
Abbildung 31: Überlebenskurven der Stämme A methanolicus MBS8/4 und MB58/4-101 nach UV-Exposiüon
Abbildung 32: Inaküvierung der Phagen Acml, Acm2, AcmS und Acm6 durch UV-Licht
Abbildung 33: Einfluß des Wachstumszustandes des Rezipienten A. methanolicus MB58/4-101 auf die
Transduktionseffektivität mit dem Phagen Acml
Abbildung 34: Vergleichende Restriktionsanalysen der DNA aus Acm- und TAcm-Phagen
Abbildung 35: Vergleich der Muster der Hüllproteine von Acm- und TAcm-Phagen
Verzeichnisse________________________________YJI_
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Wirtsbereiche der Acm-Phagen auf Stämmen von A. methanolicus
Tabelle 2: Latenzzeit und Wurfgröße der Acm-Phagen in Abhängigkeit von der Infektionsmulbplizität
Tabelle 3: Maße der Phagen Acml, Acm2, AcmS, Acm6 und Acm7
Tabelle 4: Serologische Reaktionen der Acm-Phagen mit 3 Antiseren
Tabelle 5: Gruppierung der Acm-Phagen nach der Höhe der K-Werte
Tabelle 6: Überlebensraten der Acm-Phagen nach Temperanireinwirkungen von 1 h
Tabelle 7: Einfluß von Chloroform auf den Phagen Acml
Tabelle 8: Stabilität der Phagen Acm2-Acm7 gegen Chloroform
Tabelle 9: Charakterisäka der Acm-Phagen
Tabelle 10: Molekulargewichte der HUllproteine der Acm-Phagen
Tabelle 11: Ähnlichkeiten und Unterschiede in der Zusammensetzung der Hullproteine der Phagen Acml-Acm7
Tabelle 12: Größe der Einzelfragmente der Acm-DNA aus Abb. 22
Tabelle 13: Größe der Einzelfragmente nach Bg) I-Spaltung und SalGI-Spaltung
Tabelle 14: Vergleich der Größe der Einzelfragmente der Phagen-DNA nach EcoRI-, EcoRV- und Clal-Spaltung
Tabelle IS: Gesamtgröße der Acm-Genome als Summe der Größe der Restriktionsfragmente
Tabelle 16: Größe der Fragmente nach Einzel- und Mehrfachspaltungen von DNA des Phagen Acml
Tabelle 17: Größe der Acml-Genome, ermittelt durch Langenmessung der DNA
Tabelle 18: Zuordnung der induzierten Morphotvpen zu den A. mahanoticus Stämmen
Tabelle 19: Übersicht über Plamerungseffektmtat EOP and spontane Reversionshäufigkeit zur Prototrophie R
ausgewählter Mutanten von A. methanoücus MB 58/4
Tabelle 20: Einfluß der UV-Bestrahlung der Acml-Pbagen auf die Höhe der Transduktion des His-Markers
Tabelle 21: Vergleich von parallelen Trm«dnWipp««pfriTT»t«iii unter optimierten Bedingungen und einer MOI=1
Tabelle 22: Transduknonseffektivitat (EOT) weiterer auxotropher Marker
Verzeichnisse________________________________VHI
Tabelle 23: Transfektion von A. methanolicus-S catxa mit DNA der Acm-Phagen
Tabelle 24: Wirtsbereiche von transfektierten (TAcm) und Wildtypphagen auf A. mahanoUcus Stammen
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