Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen humanem und murinem LASP (LIM- und SH3-Protein):
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| Sprache: | German |
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2005 [erschienen] 2006
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1.Einleitung 1
1.1.Proteinaufbau und bisher identifzierte Phosphorylierungsstellen von LASP 1 1
1.2.ZielSetzung der Arbeit 3
2.Material 5
2.1.Bakterien (E. coli) 5
2.1.1. Bakterien Stämme 5
2.1.2.Medien und Agarplatten für Bakterien 5
2.2.Kulturzellen 5
2.3.Lösungen, Medien und Seren für die Zellkultur 5
2.4.Vektoren 6
2.5.Oligonukleotid Primer 6
2.6.Chemikalien und Reagenzien 9
2.7.Enzyme 10
2.8.Proteine 10
2.9.Größenstandards 10
2.1 O.Kits 10
2.11 Transfektionsreagenz 10
2.12. Antikörper 10
2.13. Verbrauchsmaterialien 11
2.14.Geräte 11
3.Molekularbiologische Methoden 12
3.1 RNA Isolierung aus Mäusegeweben 12
3.2.Klonierung von murinem LASP 1 12
3.3Transformation kompetenter E. coli Zellen 13
3.4.Aufbewahrung von E. coli Stämmen als Glycerinkulturen 13
3 5Agarose Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA Fragmenten 13
3 6.1solierung von Plasmid DNA mit dem Plasmid Mini Kit (Qiagen) 14
3.7.1solierung von Plasmid DNA mit dem Plasmid Maxi Kit (Qiagen) 14
3.8.Amplifizierung von DNA Fragmenten durch die PCR 15
3.9.Splice overiap extension Methode zur gezielten Einführung von Punktmutationen mittels
PCR 15
3.10. Verdau von Plasmid DNA mit Restriktionsendonukleasen 17
3.11 Isolierung von DNA Fragmenten nach Restriktionsverdau aus Agarose Gelen mit dem
QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) 18
3.12.Ligation von DNA Fragmenten 18
3.13.DNA SequenzierungmitdemCEQ8OOO 18
4.Proteinbiocbemische Metboden 20
4.1.Denaturierende Gel Elektrophorese nach Läemmli (1970) 20 i
4.2.Proteingelfärbung mit Serva Blau G (kolloidale Coomassiefarbung) 21
4.3.Trocknen von Polyacrylamidgelen 21
4.4.WesternBlot(Towbinetal.,1979) 22
4.4.1. Transfer auf die Nitrocellulosemembran 22
i
4.4.2.Anfärben von Proteinen auf der Nitrocellulose 22
4.4.3.Detektion spezifischer Proteine mit Antikörpern 22 •
4.5.Überexpression und Reinigung von GST Fusionsproteinen in E. coli 23
4.5.1.ReinigungvonGST LASP l mit GSH Solution 25 *
4.5.2.ReinigungvonLASP l mit Thrombin 25
4.5.3.ReinigungvonLASP l mit immobilisiertem Thrombin 26
4.6.Proteinbestimmung mit dem BCA Test 26
4.7.Chemische Kreuzvernetzung von LASP 1 Protein 27
4.8.NC Overlay zum Nachweis von LASP 1 bindenden Proteinen 27
4.8.1.Eindimensionaler NC Overlay 27
4.8.2.ZweidimensionalerNC Overlay humaner Blutplättchen 28
4.8.3.Nachweis von gebundenem, radioaktiv markierten LASP 1 Protein 29
4.8.4.Nachweis von gebundenem, nicht radioaktiven LASP 1 Protein durch Westem Blot... 30
4.9.In vitro Phosphorylierung von Mouse LASP 1 30
4.10.Transfektion adhärenter PtK2 Zellen und in vivo Phosphorylierung von Mouse LASP 1.31
4.11.Präparation von murinen Organgeweben zum Proteinnachweis 31
4.12.Präparation und Stimulation von murinen WT Blutplättchen 32
4.13.Immunfluoreszenzmikroskopie 32
5.Zellkultur. 34
5.1. Kulturbedingungen 34
5.2.Splitten adhärenter Zellen 34
5.3.Einfrieren und Auftauen von Kulturzellen 34
6.Ergebnisse.__.™......„_..„........„„_„„..„..„„„_„„„MM_ , .... 35
6.l.In vitroPhosporylierung von murinem LASP 1 an Ser 61, Ser 99undThr 156 35 )
6.2.In vivo Phosphorylierung von murinem LASP 1 an Thr 156 38
6.3.Stimulation von murinen WT Blutplättchen 39
6.4.Humanes und murines LASP 1 sind Monomere 40
t
6.5.LASP 1 bindet an prolinreiche Domäne Proteinen 41
6.6.Die Expression von LASP 1 in humanen und murinen Geweben 43
6.7.DieRelokalisation von murinem LASP 1 nach Forskolinstimulation 44
7.Diskussion „ 46
8.Zusammenfassung 49
9.Abkürzuiigen 50
10.Literaturverzeichnis 52
|
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Inhaltsverzeichnis
1.Einleitung 1
1.1.Proteinaufbau und bisher identifzierte Phosphorylierungsstellen von LASP 1 1
1.2.ZielSetzung der Arbeit 3
2.Material 5
2.1.Bakterien (E. coli) 5
2.1.1. Bakterien Stämme 5
2.1.2.Medien und Agarplatten für Bakterien 5
2.2.Kulturzellen 5
2.3.Lösungen, Medien und Seren für die Zellkultur 5
2.4.Vektoren 6
2.5.Oligonukleotid Primer 6
2.6.Chemikalien und Reagenzien 9
2.7.Enzyme 10
2.8.Proteine 10
2.9.Größenstandards 10
2.1 O.Kits 10
2.11 Transfektionsreagenz 10
2.12. Antikörper 10
2.13. Verbrauchsmaterialien 11
2.14.Geräte 11
3.Molekularbiologische Methoden 12
3.1 RNA Isolierung aus Mäusegeweben 12
3.2.Klonierung von murinem LASP 1 12
3.3Transformation kompetenter E. coli Zellen 13
3.4.Aufbewahrung von E. coli Stämmen als Glycerinkulturen 13
3 5Agarose Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA Fragmenten 13
3 6.1solierung von Plasmid DNA mit dem Plasmid Mini Kit (Qiagen) 14
3.7.1solierung von Plasmid DNA mit dem Plasmid Maxi Kit (Qiagen) 14
3.8.Amplifizierung von DNA Fragmenten durch die PCR 15
3.9.Splice overiap extension Methode zur gezielten Einführung von Punktmutationen mittels
PCR 15
3.10. Verdau von Plasmid DNA mit Restriktionsendonukleasen 17
3.11 Isolierung von DNA Fragmenten nach Restriktionsverdau aus Agarose Gelen mit dem
QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) 18
3.12.Ligation von DNA Fragmenten 18
3.13.DNA SequenzierungmitdemCEQ8OOO 18
4.Proteinbiocbemische Metboden 20
4.1.Denaturierende Gel Elektrophorese nach Läemmli (1970) 20 i
4.2.Proteingelfärbung mit Serva Blau G (kolloidale Coomassiefarbung) 21
4.3.Trocknen von Polyacrylamidgelen 21 '
4.4.WesternBlot(Towbinetal.,1979) 22
4.4.1. Transfer auf die Nitrocellulosemembran 22
i
4.4.2.Anfärben von Proteinen auf der Nitrocellulose 22
4.4.3.Detektion spezifischer Proteine mit Antikörpern 22 •
4.5.Überexpression und Reinigung von GST Fusionsproteinen in E. coli 23 '
4.5.1.ReinigungvonGST LASP l mit GSH Solution 25 *
4.5.2.ReinigungvonLASP l mit Thrombin 25 '
4.5.3.ReinigungvonLASP l mit immobilisiertem Thrombin 26 '
4.6.Proteinbestimmung mit dem BCA Test 26
4.7.Chemische Kreuzvernetzung von LASP 1 Protein 27
4.8.NC Overlay zum Nachweis von LASP 1 bindenden Proteinen 27
4.8.1.Eindimensionaler NC Overlay 27
4.8.2.ZweidimensionalerNC Overlay humaner Blutplättchen 28
4.8.3.Nachweis von gebundenem, radioaktiv markierten LASP 1 Protein 29
4.8.4.Nachweis von gebundenem, nicht radioaktiven LASP 1 Protein durch Westem Blot. 30
4.9.In vitro Phosphorylierung von Mouse LASP 1 30 '
4.10.Transfektion adhärenter PtK2 Zellen und in vivo Phosphorylierung von Mouse LASP 1.31
4.11.Präparation von murinen Organgeweben zum Proteinnachweis 31 '
4.12.Präparation und Stimulation von murinen WT Blutplättchen 32
4.13.Immunfluoreszenzmikroskopie 32 '
5.Zellkultur. 34
5.1. Kulturbedingungen 34 '
5.2.Splitten adhärenter Zellen 34
5.3.Einfrieren und Auftauen von Kulturzellen 34 '
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6.2.In vivo Phosphorylierung von murinem LASP 1 an Thr 156 38
6.3.Stimulation von murinen WT Blutplättchen 39
6.4.Humanes und murines LASP 1 sind Monomere 40
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6.5.LASP 1 bindet an prolinreiche Domäne Proteinen 41
6.6.Die Expression von LASP 1 in humanen und murinen Geweben 43
6.7.DieRelokalisation von murinem LASP 1 nach Forskolinstimulation 44
7.Diskussion „ 46
8.Zusammenfassung 49
9.Abkürzuiigen 50
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