Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) als Methode zur Mutationsuche im MSH6-Gen bei Patienten mit Verdacht auf HNPCC (Hereditäres nicht-polypöses kolorektales Karzinom):
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Karzinogenese 1
1.2 Das Hereditäre nichtpolypöse kolorektale Karzinom (HNPCC) 2
1.1.2 Das Krankheitsbild 2
1.2.2 Molekulargenetische Grundlagen 5
1.3 DashMSH6 Gen 7
1.4 Techniken zur Detektion von Sequenzvarianten 10
1.5 HNPCC Vorsorgeprogramm 11
2 Zielstellung 13
3 Material und Methoden 14
3.1 Patienten und Einschlußkriterien 14
3.2 Technische Ausrüstung und Materialien 14
3.3 Reagenzien 15
3.3.1 Reagenzien 15
3.3.2 Lösungen und Puffer 16
3.3.3 Enzyme 17
3.3.4 Standards und Farbstoffe 17
3.3.5 Kommerzielle Kits 17
3.3.6 Primer 17
3.4 Softwareprogramme, Datenbanken, Sequenzen 19
3.4.1 Software zur Schmelzpunktbestimmung von PCR Produkten 19
3.4.2 ABI PRISM™ Software zur Sequenzanalyse 19
3.4.3 Mutationsdatenbanken 20
3.4.4 Sequenzen 20
3.5 Methoden 20
3.5.1 DNA Isolation 20
3.5.2 Polymerasekettenreaktion 21
3.5.3 Reaktionsansatz für PCR und PCR Programm 22
3.5.4 Elektrophorese der PCR Produkte 23
3.5.5 Reinigung der PCR Produkte 24
3.5.5.1 Qiaquick PCR Purification Kit 24
3.5.6 Kontrolle der gereinigten PCR Proben mittels Agarosegelelektrophorese 25
3.5.7 Denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (DHPLC) 25
3.5.7.1 Prinzip der DHPLC 26
3.5.7.2 Mutationsdetektion mittels Temperaturmodulierter Heteroduplexanalyse 26
(TMHA)
3.5.7.3 Vorbereitung der Proben 27
3.5.7.4 Herstellung der Puffer 28
3.5.7.5 Theoretische und praktische Schmelzpunktbestimmung 28
3.5.8 Direkte DNA Sequenzierung 29
3.5.8.1 Zyklische DNA Sequenzierung mit der BigDye Terminator Technik 30
3.5.8.2 Reaktionsansatz und Sequenzierungsprogramm 30
3.5.8.3 Fällung der Sequenzierungsprodukte 31
3.5.8.4 Elektrophorese und Detektion der Sequenzierprodukte im ABI 32
PRISM™377 Sequenzautomaten
3.5.8.5 Vorbereitungen und Gelherstellung 32
3.5.8.6 Sequenzbestimmung im ABI PRISM™377 Sequenzautomaten 33
3.5.8.7 Auswertung der Analysedaten 33
4 Ergebnisse 34
4.1 Patienten 34
4.2 Ergebnisse der Polymerasekettenreaktion 35
4.3 Etablierung der DHPLC 36
4.3.1 Schmelzpunktbestimmung mittels DHPLC Melt Software 36
4.3.2 Ermittlung des Fließmittelgradienten 37
4.3.3 DHPLC Protokoll 38
4.3.4 Resultate des DHPLC Vorscreenings 39
4.4 Sequenzierung 41
4.4.1 Bestimmung der einzusetzenden DNA Konzentration 41
4.5 Nachgewiesene Sequenzvarianten im hMSH6 Gen 41
4.5.1 Polymorphismen und Unklassifizierte Varianten 42
4.5.2 Mutationen 44
4.6 Übereinstimmung der Ergebnisse von DHPLC Vorscreening und 45
Direktsequenzierung
5 Diskussion 46
5.1 Ergebnisdikussion 46
5.1.1 Missense Mutationen 47
5.1.2 Im Patientenkollektiv nachgewiesene Missense Mutation 47
5.1.3 Mutationen im Umfeld von T1225M 50
5.1.4 Im Patientenkollektiv nachgewiesene Polymorphismen 51
5.1.5 Im Patientenkollektiv nachgewiesene Unklassifizierte Varianten 53
5.2 Genotyp Phänotyp Korrelation beim HNPCC Syndrom 54
5.3 DHPLC als Mutationsscreening Verfahren 57
6 Zusammenfassung 60
Literaturverzeichnis I
Bildnachweis VIII
Abkürzungsverzeichnis IX
|
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Karzinogenese 1
1.2 Das Hereditäre nichtpolypöse kolorektale Karzinom (HNPCC) 2
1.1.2 Das Krankheitsbild 2
1.2.2 Molekulargenetische Grundlagen 5
1.3 DashMSH6 Gen 7
1.4 Techniken zur Detektion von Sequenzvarianten 10
1.5 HNPCC Vorsorgeprogramm 11
2 Zielstellung 13
3 Material und Methoden 14
3.1 Patienten und Einschlußkriterien 14
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3.4.3 Mutationsdatenbanken 20
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3.5.2 Polymerasekettenreaktion 21
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3.5.5.1 Qiaquick PCR Purification Kit 24
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3.5.7 Denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (DHPLC) 25
3.5.7.1 Prinzip der DHPLC 26
3.5.7.2 Mutationsdetektion mittels Temperaturmodulierter Heteroduplexanalyse 26
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3.5.7.3 Vorbereitung der Proben 27
3.5.7.4 Herstellung der Puffer 28
3.5.7.5 Theoretische und praktische Schmelzpunktbestimmung 28
3.5.8 Direkte DNA Sequenzierung 29
3.5.8.1 Zyklische DNA Sequenzierung mit der BigDye Terminator Technik 30
3.5.8.2 Reaktionsansatz und Sequenzierungsprogramm 30
3.5.8.3 Fällung der Sequenzierungsprodukte 31
3.5.8.4 Elektrophorese und Detektion der Sequenzierprodukte im ABI 32
PRISM™377 Sequenzautomaten
3.5.8.5 Vorbereitungen und Gelherstellung 32
3.5.8.6 Sequenzbestimmung im ABI PRISM™377 Sequenzautomaten 33
3.5.8.7 Auswertung der Analysedaten 33
4 Ergebnisse 34
4.1 Patienten 34
4.2 Ergebnisse der Polymerasekettenreaktion 35
4.3 Etablierung der DHPLC 36
4.3.1 Schmelzpunktbestimmung mittels DHPLC Melt Software 36
4.3.2 Ermittlung des Fließmittelgradienten 37
4.3.3 DHPLC Protokoll 38
4.3.4 Resultate des DHPLC Vorscreenings 39
4.4 Sequenzierung 41
4.4.1 Bestimmung der einzusetzenden DNA Konzentration 41
4.5 Nachgewiesene Sequenzvarianten im hMSH6 Gen 41
4.5.1 Polymorphismen und Unklassifizierte Varianten 42
4.5.2 Mutationen 44
4.6 Übereinstimmung der Ergebnisse von DHPLC Vorscreening und 45
Direktsequenzierung
5 Diskussion 46
5.1 Ergebnisdikussion 46
5.1.1 Missense Mutationen 47
5.1.2 Im Patientenkollektiv nachgewiesene Missense Mutation 47
5.1.3 Mutationen im Umfeld von T1225M 50
5.1.4 Im Patientenkollektiv nachgewiesene Polymorphismen 51
5.1.5 Im Patientenkollektiv nachgewiesene Unklassifizierte Varianten 53
5.2 Genotyp Phänotyp Korrelation beim HNPCC Syndrom 54
5.3 DHPLC als Mutationsscreening Verfahren 57
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Bildnachweis VIII
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