Untersuchung der molekularen Funktion von Netrin-4 in der Angiogenese:
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| adam_text | Titel: Untersuchung der molekularen Funktion von Netrin-4 in der Angiogenese
Autor: Kaltenberg, Jennifer
Jahr: 2013
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung I
Abstract II
1. Einleitung 1
1.1 Gefäßentwicklung 1
1.1.1 Vaskulogenese und Angibgenese 1
1.1.2 Das reife vaskuläre Netzwerk 3
1.1.3 Endothelzellen und Lamininexpression 5
1.2 Die Basalmembran 6
1.2.1 Laminine und Laminin-Polymerisation 8
1.2.2 Kollagen-IV und Kollagen-IV-Polymerisation 9
1.3. Die Netrin-Proteinfamilie 10
1.3.1 Strukturelle Eigenschaften der Netrine 11
1.3.2 Lokalisation der Netrine im Gewebe und Funktion 12
1.3.2.1 Netrin-1 12
1.3.2.2 Netrin-2 13
1.3.2.3 Netrin-3 13
1.3.2.4 Netrin-4 13
1.3.2.5 Netrin-G1 und -G2 14
1.3.3 Rezeptoren der Netrine 14
1.3.4 Netrin-defiziente Mausmodelle 16
1.3.5 Netrine in der Angiogenese 16
1.4. Ziel der Arbeit 19
2. Material und Methoden 20
2.1. Material 20
2.1.1 Puffer 20
2.1.2 Nährmedien für Prokaryoten 21
2.1.3 Zellkulturmedien für eukaryotische Zellen 21
2.1.4 Zellen 22
2.1.5 Antikörper 22
2.1.5.1 Primärantikörper 22
2.1.5.2 Sekundärantikörper 23
2.1.6 Oligonukleotide 24
2.1.7 Vektoren 25
2.1.7.1 Klonierungs-und Sequenziervektor 25
2.1.7.2 Eukaryotischer Expressionsvektor 25
2.1.8 Proteine 26
2.2 Methoden 28
2.2.1 Zellbiologische Methoden 28
2.2.1.1 Kultivierung von Zellen 28
2.2.1.2 Transfektion und eukaryotische Proteinexpression 28
2.2.1.3 Kryokonservierung von Zellen 29
2.2.1.4 Isolierung primärer Endothel zeilen aus Mäuselungen 29
2.2.1.5 Zelladhäsionsexperimente 30
2.2.1.6 Zellviabilitätsassay 30
2.2.1.7 Durchflusszytometrie 31
2.2.1.7.1 Durchflusszytometrische Analyse von Oberflächenantigenen 31
2.2.1.7.2 Bestimmung apoptotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie 32
2.2.1.7.3 Durchflusszytometrische Bestimmung der Bindung von Proteinen 32
2.2.1.8 Tubulogenese-Assay 33
2.2.1.8.1 Anwendungen von Kokulturen im Tubulogenese-Assay 34
2.2.1.9 Nachweis von Zelladhäsion und Zellausbreitung auf verschiedenen 35
Substraten
2.2.1.10 Untersuchung der Migration mittels in vitro Verwundungsstudien 35
2.2.1.11 Sphäroid-Kulturen 35
2.2.1.12 Rasterelektronenmikroskopie (REM) 36
2.2.1.13 Elektronenmikroskopie (EM) 37
2.2.2 Histologische Methoden 37
2.2.2.1 Immunfluoreszenzfärbung 37
2.2.3 Molekularbiologische Methoden 38
2.2.3.1 Polymerasekettenreaktion (PCR) 38
2.2.3.2 Klonierung von Hybridkonstrukten mittels überlappender PCR 38
2.2.3.3 Anwendung der PCR zur zielgerichteten Mutagenese 39
2.2.3.4 Klonierung von Konstrukten 40
2.2.3.4.1 Agarose-Gelelektrophorese 40
2.2.3.4.2 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 40
2.2.3.4.3 Restriktionsverdau 40
2.2.3.4.4 Ligation 41
2.2.3.4.5 Transformation 41
2.2.3.4.6 Plasmidpräparation 41
2.2.3.4.7 Bestimmung der DNA-Konzentration 41
2.2.3.4.8 Sequenzierung 41
2.2.4 Proteinbiochemische Methoden 42
2.2.4.1 Aufreinigung eukaryotischer Proteine 42
2.2.4.2 Herstellung von Proteinlysaten 42
2.2.4.3 Ermittlung von Proteinkonzentrationen 43
2.2.4.4 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SOS-Page) 43
2.2.4.5 Westernblot-Analyse 43
2.2.4.6 Zirkulardicroismus (CD)-Spektroskopie 44
2.2.4.7 Enzyme-linked immunosorbent (ELISA)-ähnliche Bindungsstudien 45
2.2.4.8 Laminin- und Matrigel-Polymerisation 45
2.2.5 Auswertung und Statistik 46
3. Ergebnisse 47
3.1 Eukaryotische Expression rekombinanter Proteine 47
3.2 Funktionale Untersuchung von Netrin-4 48
3.2.1 Anwendung des Tubulogenese-Assays als in vitro Angiogenese-Modell 48
3.2.2 Analyse der Wirkung von Netrin-4 auf Proliferation und Apoptose 52
3.2.3 Analyse der Wirkung von Netrin-4 auf die Migration 54
3.2.4 Analyse der Wirkung von Netrin-4 auf Adhäsion und Signaltransduktion 55
3.2.5 Analyse der Wirkung von Netrin-4 auf Sphäroid-Kulturen 56
3.3 Bestimmung der aktiven Domäne von Netrin-4 58
3.3.1 Anwendung von Chimären Netrin-4-Laminin y1 Molekülen 58
3.3.2 Sequenzvergleich der 1. LE-Domäne von Netrin-4 mit verwandten 59
Proteinen
3.3.3 M utagenese der identifizierten Sequenz innerhalb der 1. LE-Domäne 62
3.3.4 Vergleichende Analyse der funktionalen Wirkung von Netrin-4 und den 64
mutierten Formen auf die Adhäsion
3.3.5 CD-Spektroskopische Analyse der mutierten Netrin-4 Proteine 65
3.4 Analyse der Bindungseigenschaften von Netrin-4 66
3.4.1 Untersuchung der Bindung von Endothelzellen an immobilisiertes Netrin-4 66
3.4.2 Analyse potentieller Bindungspartner von Netrin-4 68
3.4.3 Analyse der Bindung von Netrin-4 an Endothelzellnetzwerke 72
3.4.4 ELISA-ähnliche Bindungsstudien zur Ermittlung der Bindung auf 76
Proteinebene
3.4.5 Analyse der Wirkung von Netrin-4 auf Polymerisation 78
3.4.6 Analyse der Netrin-4 Funktion auf einer Laminin-111 -Matrix 79
3.4.7 Elektronenmikroskopische Analyse von Endothelzellstrukturen auf 81
Matrigel
3.5 Isolierung und Charakterisierung primärer muriner Endothelzellen 82
3.5.1 Isolierung primärer Endothelzellen 82
3.5.2 Funktionale Analyse Netrin-4 defizienter Endothelzellen 83
3.6 Vergleichende Analyse von Netrin-4 mit anderen Angiogenese-Inhibitoren 87
4. Diskussion 93
4.1 Funktionale Untersuchung von Netrin-4 93
4.2 Bestimmung der aktiven Domäne von Netrin-4 96
4.3 Identifikation des zellulären Interaktionspartners von Netrin-4 97
4.4 Charakterisierung primärer muriner Netrin-4 defizienter Endothelzellen 102
4.5 Vergleichende Analyse von Netrin-4 mit den Angiogenese-Inhibitoren 104
Tumstatin, Endostatin und Anastellin
4.6 Ausblick 107
Literaturverzeichnis III
Abkürzungen Xiil
Danksagung XV
Publikationen XVI
Erklärung XVII
Lebenslauf xvili
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