In-vitro-Charakterisierung der osteoblastären Apoptose und ihre Beeinflussung durch potentiell knochenanabole Substanzen:
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DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES
DER FAKULTAET FUER CHEMIE UND PHARMAZIE DER LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET
MUENCHEN
IN VITRO CHARAKTERISIERUNG DER OSTEOBLASTAEREN APOPTOSE UND IHRE
BEEINFLUSSUNG DURCH POTENTIELL KNOCHENANABOLE SUBSTANZEN
VON
ANGELA IHBE AUS OBERGUENZBURG
1995
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
1. PROBLEMSTELLUNG 1
2. EINLEITUNG 2
2.1. DIE OSTEOPOROSE 2
2.1.1. KLINISCHE KLASSIFIZIERUNG 2
2.1.2. AETIOLOGIE UND PATHOGENESE 3
2.1.3. PERSPEKTIVEN DER OSTEOPOROSEFORSCHUNG 5 2.2. DER OSTEOBLAST 6
2.2.1. HERKUNFT, MORPHOLOGIE, FUNKTION 6
2.2.2. CHARAKTERISTISCHE GENE DER OSTEOBLASTEN- DIFFERENZIERUNG 8
2.2.3. IN VITRO MODELLE 12
2.3. DIE APOPTOSE 15
2.3.1. BEGRIFFSKLAERUNG, BIOLOGISCHE RELEVANZ 15 2.3.2. APOPTOSE
REGULIERENDE GENE 17
2.4. DIE BEDEUTUNG VON APOPTOSE IM KNOCHENSTOFFWECHSEL 19 2.5. THERAPIE
DER OSTEOPOROSE 22
2.5.1. THERAPIEKONZEPTE, KLINISCHE ERFAHRUNGEN 22 2.5.2. KNOCHENWIRKSAME
PHARMAKA 23
2.6. DIE ROS 17/2.8 ZELLINIE ALS FORSCHUNGSMODELL ..27
3. MATERIAL 29
3.1. GERAETE 29
3.2. MATERIALIEN 29
3.3. CHEMIKALIEN 30
3.4. ENZYME UND REAKTIONSPUFFER 31
3.5. NUKLEOTIDE 32
3.6. LOESUNGEN 33
3.7. NAEHR- UND KULTURMEDIEN 35
3.8. KITS UND PLASMIDE 35
3.9. TESTSUBSTANZEN : 35
3.10.OLIGONUKLEOTIDE 36
3.11.VEKTOREN, BAKTERIEN UND EUKARYONTISCHE ZELLEN 37
4. METHODEN 38
4.1. ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 38
4.1.1. AUFZUCHT UND HALTUNG DER RATTENOSTEOSARKOMZELLINIE ROS 17/2.8 38
4.1.2. EINFRIEREN UND AUFTAUEN DER ZELLEN 38
4.1.3. MYKOPLASMENTEST 39
4.2. STANDARDVERSUCHSPROTOKOLL DES ROS 17/2.8 IN VITRO MODELLS. 39
IMAGE 3
II
4.3. METHODEN ZUR CHARAKTERISIERUNG UND VALIDIERUNG DES IN VITRO SYSTEMS
41
4.3.1. ZELLZAHLBESTIMMUNG 41
4.3.2. MESSUNG DES GESAMTPROTEINS 41
4.3.3. TRYPANBLAU ASSAY ZUR BESTIMMUNG DER ZELLVITALITAET..42 4.3.4.
BESTIMMUNG DER KLONIERUNGS-AUSBEUTE 43 4.3.5. BESTIMMUNG DER
LAKTATDEHYDROGENASE 43
4.3.6. HISTOCHEMISCHER NACHWEIS DER ALKALISCHEN PHOSPHATASE 44
4.4. METHODEN ZUR ANALYSE APOPTOTISCHER PROZESSE 44 4.4.1.
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSEN 44
4.4.2. RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE 45
4.4.3. TRANSMISSIONSELEKRONENMIKROSKOPIE 46 4.4.4. ISOLIERUNG
GENOMISCHER DNS 46
4.4.4.1. PHENOLEXTRAKTION VON NUKLEINSAEUREN 46 4.4.4.2. ETHANOLFAELLUNG
VON NUKLEINSAEUREN 47 4.4.4.3. RNASE A UND PROTEINASE K VERDAU 47
4.4.4.4. BESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREKONZEN-
TRATIONEN UEBER UV-ABSORPTION 47
4.4.5. GELELEKTROPHORETISCHE ANALYSE FRAGMENTIERTER, GENOMISCHER DNS 47
4.4.6. RADIOAKTIVE MARKIERUNG GENOMISCHER DNS MIT HILFE DER TERMINALEN
TRANSFERASE R 48
4.4.7. IN SITU DETEKTION FRAGMENTIERTER DNS DURCH DIE TUNEL FAERBEMETHODE
49
4.4.7.1. SILANISIEREN VON OBJEKTTRAEGERN 49
4.4.7.2. ZYTOSPINS 49
4.4.7.3. TUNEL FAERBUNG 49
4.4.8. APOPTOSEQUANTIFIZIERUNG ..50
4.5. METHODEN ZUR GEWINNUNG VON DNS-SONDEN 51
4.5.1. REVERSE TRANSKRIPTION 51
4.5.2. POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 51
4.5.3. PLASMIDVEKTOREN 53
4.5.4. STICKY-END -KLONIERUNG....: 54
4.5.4.1. QUANTITATIVE ASYMMETRISCHE LINEARISIERUNG VON PBLUESCRIPT SK+
54
4.5.4.2. LIGATION MIT T4-DNS-LIGASE 55
4.5.5. BLUNT-END -KLONIERUNG 55
4.5.5.1. QUANTITATIVER RESTRIKTIONSVERDAU VON PBLUESKRIPT SK+ MIT ECORV
55
4.5.5.2. PHOSPHATASE-BEHANDLUNG DES PBLUESCRIPT SK+VEKTORS 56
4.5.5.3. AUFFUELLREAKTION MIT KLENOW-POLYMERASE 56 4.5.5.4. LIGATION 56
IMAGE 4
III
4.5.6. TA CLONING-VERFAHREN 56
4.5.7. HERSTELLUNG UND TRANSFORMATION VON XLL-BLUE- ZELLEN DURCH
ELEKTROPORATION 57
4.5.7.1. HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN FUER DIE ELEKTROPORATION: 58
4.5.7.2. ELEKTROPORATION KOMPETENTER XLL-BLUE- ZELLEN 58
4.5.8. TA CLONING TRANSFORMATION 59
4.5.9. AUSPLATTIEREN TRANSFORMIERTER BAKTERIEN MIT ANSCHLIESSENDER
BLAU-WEISS SELEKTIONIERUNG 59 4.5.10.UEBERPRUEFUNG VON BAKTERIENKOLONIEN
MIT DEM KOCHSCHNELLTEST 60
4.5.11.UEBERSICHT UEBER DIE DURCHGEFUEHRTEN KLONIERUNGEN 61
4.5.12.PLASMIDPRAEPARATION IM GROSSEN MASSSTAB 61 4.5.13.ENZYMATISCHE
SEQUENZIERUNG VON DNS NACH SANGER.62 4.5.13.1. PRINZIP DER
DIDESOXY-METHODE 62
4.5.13.2. SEQUENZIERUNG VON DNS MIT DER T7-DNS- POLYMERASE 63
4.5.13.3. DENATURIERUNG UND ANNEALING DOPPEL- STRAENGIGER PLASMID-DNS
63
4.5.13.4. DENATURIERUNG UND ANNEALING VON PCR- PRODUKTEN 63
4.5.13.5. SEQUENZIERUNGSREAKTION 64
4.5.13.6. POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE UND AUTORADIOGRAPHIE 65
4.6. NORTHERN BLOT ANALYSEN 66
4.6.1. RNS-ISOLIERUNG 66
4.6.2. GELELEKTROPHORESE 67
4.6.3. BLOTTINGPROZEDUR 67
4.6.4. DNS-SONDEN FUER NORTHERN BLOTS 67
4.6.5. AUFREINIGUNG SUBKLONIERTER DNS SONDEN 70 4.6.6. HERSTELLUNG
RADIOAKTIVER DNS-SONDEN MITTELS RANDOM PRIMING 71
4.6.7. NUKLEINSAEUREHYBRIDISIERUNG DER NORTHERN BLOTS 72 4.6.8.
OLIGO-AUSWAHL ZUR DETEKTION DER 28S RRNS BANDE...73 4.6.9. HERSTELLUNG
RADIOAKTIV MARKIERTER OLIGONUKLEOTIDE MITTELS 5 -ENDMARKIERUNG 73
4.6.10.OLIGOHYBRIDISIERUNG DER 28S RRNS BANDE DER NORTHERN BLOTS 74
4.6.11.AUSWERTUNG DER AUTORADIOGRAPHIEN DURCH LASER- DENSITOMETRIE 75
4.7. STATISTIK 76
IMAGE 5
IV
5. ERGEBNISSE 77
5.1. ZELLBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN AM ROS 17/2.8 IN VITRO MODELL 77
5.1.1. MORPHOLOGISCHE UND HISTOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG 77
5.1.2. UNTERSUCHUNG VON WACHSTUMSPARAMETERN 80 5.1.3.
ZELLVITALITAETSSTUDIEN 82
5.1.4. ZELLBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN IM UEBERBLICK 84 5.2. PHAENOTYPISCHE
CHARAKTERISIERUNG DES IN VITRO MODELLS AUF GENEXPRESSIONSEBENE 85
5.2.1. HERUNTERREGULIERTE GENE 85
5.2.2. KONSTANT EXPRIMIERTE GENE 92
5.2.3. SERUM-REGULIERTE GENE 95
5.2.4. EINFLUSS VARIIERENDER VERSUCHSBEDINGUNGEN AUF DIE EXPRESSION
OSTEOBLASTAERER MARKERGENE 97 5.2.5. DIE GENEXPRESSIONSANALYSEN IM
UEBERBLICK 101 5.3. NACHWEIS VON APOPTOSE ALS ENDPUNKT DES IN VITRO
MODELLS. 102
5.3.1. MORPHOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DER APOPTOSE 103
5.3.2. BIOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUR APOPTOSE. 108 5.3.3.
MORPHOLOGISCHE UND BIOCHEMISCHE CHARAKTERISTIKA DER OSTEOBLASTAEREN
APOPTOSE IM UEBERBLICK 112
5.4. MECHANISTISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUR OSTEOBLASTAEREN APOPTOSELL2 5.4.1.
APOPTOSEINDUKTION DURCH GAMMASTRAHLUNG 113 5.4.2. GENEXPRESSIONSANALYSEN
VERSCHIEDENER APOPTOSEGENE 115
5.4.3. MECHANISTISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUR OSTEOBLASTAEREN APOPTOSE IM
UEBERBLICK 122
5.5. CHARAKTERISIERUNG DER OSTEOBLASTAEREN LEBENSSPANNE UNTER EINFLUSS
KNOCHENANABOLER SUBSTANZEN 122
5.5.1. WACHSTUMSFAKTORANREICHERUNG 123
5.5.2. TESTUNG POTENTIELL KNOCHENANABOLER SUBSTANZEN 128 5.5.3. DIE
CHARAKTERISIERUNG DER OSTEOBLASTAEREN LEBENSSPANNE UNTER EINFLUSS
KNOCHENANABOLER SUBSTANZEN IM UEBERBLICK 139
IMAGE 6
6. DISKUSSION 140
6.1. DIE ROS 17/2.8 ZELLINIE ALS FORSCHUNGSMODELL 140 6.2. ZEIL- UND
MOLEKULARBIOLOGISCHE CHARAKTERISTIKA DES ROS 17/2.8 IN VITRO MODELLS 141
6.3. DIE OSTEOBLASTAERE APOPTOSE 143
6.4. DIE VERLAENGERUNG DER OSTEOBLASTAEREN LEBENSSPANNE ALS
KNOCHENANABOLES THERAPIEPRINZIP 149
6.5. AUSBLICK 155
7. ZUSAMMENFASSUNG 156
8. LITERATUR 158
9. ABKUERZUNGEN 183
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