Isolierung und Charakterisierung des Oozyten aktivierenden Spermienfaktors bei Sus scorfa:
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VI
INHALT
1 EINLEITUNG 1
1.1 OOZYTE UND SPERMIUM 1
1.2 FERTILISATION
L
1.3 SPERMIEN INTERAKTION MIT DER EIPLASMA-MEMBRAN 2
1.4 AKTIVIERUNG DER EIZELLE 3
1.4.1 FRUEHE EREIGNISSE DER EIZELL-AKTIVIERUNG 3
1.4.2 SPAETE EREIGNISSE DER EIZELL-AKTIVIERUNG 4
1.5 AUSLOESER DER EIZELL-AKTIVIERUNG 4
1.6 CALCIUM 5
1.7 CALCIUM UND DIE EIZELLE 5
1 .8 WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN CALCIUM-SIGNAL UND MPF 6
1.9 MOEGLICHE MECHANISMEN DES
[CA2+]R ANSTIEGS 6
1.10 PHOSPHOLIPASEN-AKTIVIERUNG 7
1.10.1
PHOSPHOLIPASEN C (PLC) 7
1.10.2
FUNKTION DER PLC BEI DER ERZEUGUNG VON DER CALCIUM-WELLE 8
1.11 TYROSINKINASE AKTIVITAET: FUNKTION BEI DER BEFRUCHTUNG 9
1.12 KUENSTLICHE STIMULIERUNG ODER INHIBIERUNG DER TYROSINKINASE 9
1.12.1 KUENSTLICHE STIMULIERUNG 9
1.12.2 INHIBIERUNG 10
1.13 PROTEINE, DIE DURCH NICHT REZEPTOR-TYROSINKINASEN PHOSHORYLIERT
WERDEN, UND IHRE FUNKTION BEI DER BEFRUCHTUNG
10
1.13.1 PROTEINE DER SRC-FAMILIE 11
1.13.2 PROTEINE, DIE NICHT MITGLIEDER DER SRC-PROTEINFAMILIE SIND 12
1.14
ASSOZIATION VON
PLCT
MIT TYROSIN-PHOSPHORYLIERTEN PROTEINEN
13
1.15 FUSION VON SPERMIUM UND OOZYTE UND DIE LATENTE PERIODE 13
1.16 MODELLE 14
1.16.1 DAS REZEPTOR-MODELL 14
1.16.2 DAS SPERMIENFAKTOR-MODELL 17
1.17 KANDIDATENPROTEINE 17
1.17.1
OSZILLIN
17
1.17.2
TRUNCATED-CKIT
/ 18
1.17.3
NEUE PLC-THEORIE 18
1.17.4 NOS 18
1.17.5
CHARAKTERISTIKA DES UNBEKANNTEN PROTEINS 19
1.18 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 19
2 MATERIAL 20
2.1 CHEMIKALIEN 20
2.2 ANTIKOERPER 20
2.2.1 ANTI-NOS 20
2.2.2 WEITERE PRIMAERE ANTIKOERPER 20
2.2.3
SEKUNDAERE ANTIKOERPER
20
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/969246749
VII
2.3 PROTEIN-LAENGENSTANDARD 21
2.4
CHROMATOGRAFIE-SAEULEN 21
2.4.1
IONENAUSTAUSCHER-SAEULEN 21
2.4.2
AFFINITAETSCHROMATOGRAFIE-SAEUI.EN 21
'I
4.3 HYDROXYAPATIT-SAEULE 21
2.4.4
GELFILTATIONSSAEULEN 21
2.4.5
HYDROPHOBE-INTERAKTIONSSAEULEN 21
2.5 FLUORESZENZ-FARBSTOFFE 21
2.6
RADIOCHEMIKALIEN 21
2.7 REKOMBINANTE PROTEINE UND HORMONE 22
2.8 INHIBITOREN 22
2.9
YYKITS" 22
2.10
HAEUFIG VERWENDETE LOESUNGEN 22
2.11 CHROMATOGRAFIE-PUFFER 24
3 METHODEN 25
3.1 PROTEINANALYTIK 25
3.1.1 GEWINNUNG VON EBERSPERMIEN 25
3.1.2 AUFBEREITUNG DES EBEREJAKULATES 25
3.1.3 AUFBRECHEN DER SPERMIEN 25
3.1.4 AMMONIUMSULFATFAELLUNG 26
3.1.5 ABTRENNUNG VON SALZEN UND KONZENTRIERUNG VON PROTEINLOESUNGEN 26
3.1.6 CHROMATOGRAFISCHE TECHNIKEN 27
3.1.7 GELELEKTROPHORESE-TECHNIKEN 36
3.1.8 NACHWEISMETHODEN FUER PROTEINE IM POLYACRYLAMID-GEL 43
3.1.9 PROTEIN-BLOTTING: WESTERN-BLOT 46
3.1.10 KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN 50
3.2 IMMUNTECHNIKEN 52
3.2.1 IMMUNGLOBULIN-AUFREINIGUNG 52
3.2.2 IMMUNLOKALISATION VON PROTEINEN IN SPERMIEN 52
3.2.3 IMMUNPRAEZIPITATION 53
3.3 STICKSTOFFOXID (NO)-SYNTHASE DETEKTIONSSYSTEM 54
3.4 ZELLKULTUR-TECHNIKEN 55
3.4.1 SUPEROVULATIONSINDUZIERUNG BEI DER MAUS 55
3.4.2
OEFFNUNG DES ABDOMENS 56
3.4.3 GEWINNUNG DER EIZELLEN UND ENTFERNUNG DER KUMULUS-ZELLEN MIT
HYALURONIDASE 56
3 4.4 HERSTELLUNG VON MIKROTROPFEN-KULTUREN 58
3.5
NACHWEIS-TECHNIKEN 58
3.5.1
MIKROINJEKTION 58
3.5.2
BEGUTACHTUNG DER OOZYTEN-AKTIVATION 59
3.5.3
FLUORESZENZOPUSCHER NACHWEIS DER [CA2'],-OSZILLATION 59
3.5.4 NO-MESSUNGEN 59
4 ERGEBNISSE
61
4.1 PLCGAMMA
61
VIII
4.1.1
SIND INTERAKTIONSPARTNER DER PLQ FUER DIE AKTIVIERUNG VERANTWORTLICH? 61
4.1.2
KOMMT AKTIVIERENDE
PLC
AUS DEM SPERMIUM?
62
4.2
NO-SYNTHASE UND NO 63
4.2.1
NO
UND DIE EIZELLE
63
4.2.2
NOS
IM SPERMIUM
65
4.2.3 AUFREINIGUNG DES IOOKDA-PROTEINS 67
4.2.4 NOS- 2. AUFREINIGUNGSVERSUCH 70
4.2.5
HANDELT ES SICH BEI DER SPERMIEN-NOS UM EINE VERKUERZTE ENOS?
75
4.3 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DES CALCIUM OSZILLIERENDEN
SPERMIENFAKTORS 76
4.3.1 AUSWAHL DER GEEIGNETEN SPEZIES FUER DIE AUFREINIGUNG 76
4.3 .2 LOESLICH ODER MEMBRANSTAENDIG? 76
4.3.3 ULTRAZENTRIFUGATION 77
4.3 .4
AUSTESTUNG DER VERSCHIEDENEN CHROMATOGRAFIE-SAEULEN AUF IHRE
FUNKTIONALITAET 77
4.3.5
SAEULENKOMBINATIONEN
82
4.3.6 VERAENDERUNG DER MINI Q-CHROMATOORAFIE DURCH ANDEREN PUFFER 84
4.3.7 HEPARIN KATIONEN-AUSTAUSCHER-CHROMATOGRAFIE MIT TRIS-HCL-PUFFER 84
4.3.8 HITRAP HEPARIN-SAEULE MIT DER MINI Q-SAEULE 84
4.3.9
YYUP-SCALEN" DER SAEULEN AUF GROEBERE MATRIX-VOLUMINA
85
4.3.10 PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG 86
4.3.11 AUSTESTUNG DER FRAKTIONEN AUF CALCIUM-OZILLATION 88
4.3.12 ZWISCHENERGEBNIS 91
4.3.13 VERAENDERUNG DM DER AUFREINIGUNGSSTRATEGIE 91
4.3.14 HYDROXYAPATIT
(CHT II)
-SAEULE 93
4.3.15
KOMBINATION VON HEPARIN UND
CHT II 94
4.3.16 AMMONIUMSULFAT-FAELLUNG 94
4.3.17 SEQUENZIELLE AMMONIUMSULFAT-FAELLUNG 95
4.3.18 AMMONIUMSULFAT-FAELLUNG IN DER AUFREINIGUNGSKASKADE 95
4.3.19 HIC 95
4.3.20 KOMBINATION VON HYDROXYAPATIT- UND HEPARIN-SAEIJI,E MIT 50%IGER
AMMONIUMSULFAT-FAELLUNG 96
4.3.21 KOMBINATION VON 50%IGER AMMONIUMSULFAT-FAELLUNG, HYDROXY APATIT-
UND
HITRAP HEPARIN-SAEULE MIT MONO Q-SAEULE 97
4.3.22 TEST DER EINZELNEN FRAKTIONEN AUF CALCIUM-OSZILLATIONSFAEHIGKEIT
98
4.3.23
AUFFREINIGUNG MITTELS ENTSALZUNGSSAEULEN . 99
4.3.24
BELADUNG IN KLEINEREN SCHRITTEN
1 OO
4.3.25 SAEULENKASKADE DURCH VERDUENNUNGEN 101
4.3.26 VERAENDERUNG DER PUFFER UND YYUP-SCALEN" 102
4.4 ZWISCHENERGEBNIS: ALBUMIN 103
4.5 IST ALBUMIN DER CALCIUM OSZILLIERENDE SPERMIENFAKTOR? 105
4.5.1 INHIBIERUNG DER OSZILLATION DURCH ANTI-ALBUMIN ANTIKOERPER 105
4.5.2 INJEKTION DER SPERMIEN MIT COHN-GEREINIGTFM AI,BUMIN 107
4.5.3 LPA
UND DIE AKTIVIERUNG DER EIZELLE 107
4.5.4 ERGEBNIS ALBUMIN 107
4.5.5 ERGEBNISSE AUS DEN VERSCHIEDENEN DATENBANKEN 108
4.5.6 IST DIE PLCZ DER ISOLIERTE FAKTOR? 108
4.5.7 ERGEBNIS 109
5 DISKUSSION
110
IX
5.1 PLCR 110
5.2 NO UND
NO-SYNTHASE 111
5.2.1 NO
UND OOZYTEN 111
5.2.2 NO
UND DIE AKTIVIERUNG DER OOZYTE 111
5.2.3 NOS
IN SPERMIEN 112
5.2.4
ISOLIERUNG VON NOS 112
5.2.5
VERKUERZTE NNOS ALS MOEGLICHE SPERMIEN NOS 114
5.2.6
PARTIELLE CHARAKTERISIERUNG VON SPERMIEN-NOS 115
5.3 ISOLIERUNG DES ELZELL AKTIVIERENDEN SPERMIENFAKTORS 116
5.3.1 VORTESTS 116
5.3.2 HPLC 116
5.4 DER EIZELL AKTIVIERENDE SPERMIENFAKTOR 117
5.4.1
AUFREINIGUNG DES [CA2+]I OSZILLIERENDEN SPERMIENFAKTOR 118
5.4.2 DER [CA2+],-OSZILLIERENDEN SPERMIENFAKTOR 119
5.4.3 DAS ISOLIERTE PROTEIN IST EINE PLCZ 121
6 AUSBLICK 122
7 ZUSAMMENFASSUNG 123
8 LITERATURVERZEICHNIS 127
9 ABKUERZUNGEN
139 |
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| spelling | Heyers, Sibilla 1970- Verfasser (DE-588)128477032 aut Isolierung und Charakterisierung des Oozyten aktivierenden Spermienfaktors bei Sus scorfa von Sibilla Heyers 2003 IX, 144 Bl. Ill., graph. Darst. 30 cm txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Bonn, Univ., Diss., 2003 Wildschwein - Spermium - Cytosol - Aktivatorproteine - Oozyte Aktivatorproteine (DE-588)4290309-9 gnd rswk-swf Spermium (DE-588)4135383-3 gnd rswk-swf Wildschwein (DE-588)4066129-5 gnd rswk-swf Oozyte (DE-588)4319143-5 gnd rswk-swf Cytosol (DE-588)4285082-4 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Wildschwein (DE-588)4066129-5 s Spermium (DE-588)4135383-3 s Cytosol (DE-588)4285082-4 s Aktivatorproteine (DE-588)4290309-9 s Oozyte (DE-588)4319143-5 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=013041843&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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