Erarbeitung eines durchflusszytometrischen Tests zur Bestimmung der "antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität" (ADCC) von humanen natürlichen Killerzellen: Bestimmung der ADCC bei einer weiblichen, gesunden Kontrollgruppe und bei Patientinnen mit pathologischen Veränderungen der Brustdrüse vor und nach einem operativen Eingriff
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Seite
1. Einführung in das Thema 1
1.1. Physiologie der „Natürlichen Killerzellen (NK) 1
1.1.1. Allgemeines 1
1.1.2. Morphologie der NK 2
1.1.3. Inhibitorische und aktivierende Rezeptoren der NK 2
1.1.4. Funktionen der NK 3
1.2. Pathophysiologie der NK 5
1.2.1. NK und benigne Erkrankungen 5
1.2.2. NK und maligne Erkrankungen 8
1.3. Faktoren mit Einfluss auf die NK 11
1.3.1. NK und Lebensstil 11
1.3.2. NK, physische und psychische Belastungen 11
1.3.3. NK, Alter und Geschlecht 12
1.3.4. NK, Schwangerschaft und Hormone 12
1.3.5. NK, Zytokine und Prostaglandine 13
1.3.6. NK, Monozyten und dendritische Zellen 13
1.3.7. NK und onkologische Therapien 14
1.4. „Natürliche Zytotoxizität und „antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität 16
1.5. Das Prinzip der Durchflusszytometrie 19
1.5.1 Probenzuführung 19
1.5.2. Die Messung der Lichtstreuung 20
1.5.3. Die Messung der Fluoreszenz 20
1.5.4. Die Signalverarbeitung 21
1.5.5. Die Datenauswertung 21
1.6. Testverfahren zur Bestimmung der zytotoxischen Aktivität der NK 23
1.6.1. Chromium51 (Cr5 ) Freisetzungsverfahren 23
1.6.2. Durchflusszytometrische Methoden 26
2. Zielsetzung 26
3. Materialien und Methoden 27
3.1. Materialien 27
3.1.1. Geräte 27
3.1.2. Verbrauchsmaterialien 27
3.1.3. Zelllinien und Medien 28
3.1.4. Chemikalien und Reagenzien 28
3.1.5. Antikörper und Fluoreszenzfarbstoffe 29
3.1.6. Computer und Software 29
3.2. Vorbereitungen 30
3.2.1. Kultivierung der Targetzellen P815 30
3.2.2. Immunisierung von Kaninchen mit P815 30
3.2.3. Hitzeinaktivierung des Kaninchenserums 31
3.3. Testverfahren zur Bestimmung der ADCC 31
3.3.1. Blutentnahme 31
3.3.2. Bestimmung der Konzentration der PMNC im Blut 31
3.3.3. Gewinnung und Verarbeitung der PMNC aus dem Blut 32
3.3.4. Einstellung der Konzentration der NK auf 100 Zellen/ul 33
3.3.5. Gewinnung und Verarbeitung der Targetzellen P815 33
3.3.6. Testansätze 35
3.3.7. Durchflusszytometrische Analyse 35
3.3.8. Auswertung der Messungen mit „Cell Quest 36
3.4. Testvariationen des ADCC 39
3.4.1. Elimination der Monozyten mit Hilfe von anti-CD 14-Magnetbeads 39
3.4.2. Generierung von „Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) 41
3.4.3. Komplement-vermittelte Lyse von P815 41
3.5. Patienten, Kontrollgruppe und Probanden 42
4. Ergebnisse 44
4.1. Einfluss von Komplement im Kaninchenserum 44
4.2. Die Lyse von P815 ist unabhängig vom immunisierten Kaninchen 47
4.3. Abhängigkeit der ADCC von der Antiserumkonzentration 48
4.4. Abhängigkeit der ADCC vom Verhältnis der Effektor- zu den Targetzellen 51
4.5. Kinetik der ADCC 52
4.6. Einfluss der Monozyten auf die ADCC 54
4.7. Lyse von P815 durch „Lymphokin-aktivierte Killerzellen 56
4.8. Laborinterne Qualitätssicherung 57
4.9. ADCC der Kontrollgruppe 59
4.10. Vergleich der Kontrollgruppe mit den Patientinnen 65
4.11. Vergleich der Patientinnen vor und nach operativer Intervention 69
5. Diskussion 73
5.1. Vergleich durchflusszytometrischer Methoden und Cr5 -Freisetzungsverfahren 73
5.2. Erarbeitung eines Testverfahrens zur Bestimmung der ADCC von NK 74
5.3. ADCC der Kontrollgruppe 79
5.4. Vergleich der Kontrollgruppe mit den Patientinnen 81
5.5. Vergleich der ADCC der Patientinnen vor und nach operativer Intervention 83
6. Anhang 85
7. Zusammenfassung 93
8. Literaturverzeichnis 96
|
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Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Seite
1. Einführung in das Thema 1
1.1. Physiologie der „Natürlichen Killerzellen" (NK) 1
1.1.1. Allgemeines 1
1.1.2. Morphologie der NK 2
1.1.3. Inhibitorische und aktivierende Rezeptoren der NK 2
1.1.4. Funktionen der NK 3
1.2. Pathophysiologie der NK 5
1.2.1. NK und benigne Erkrankungen 5
1.2.2. NK und maligne Erkrankungen 8
1.3. Faktoren mit Einfluss auf die NK 11
1.3.1. NK und Lebensstil 11
1.3.2. NK, physische und psychische Belastungen 11
1.3.3. NK, Alter und Geschlecht 12
1.3.4. NK, Schwangerschaft und Hormone 12
1.3.5. NK, Zytokine und Prostaglandine 13
1.3.6. NK, Monozyten und dendritische Zellen 13
1.3.7. NK und onkologische Therapien 14
1.4. „Natürliche Zytotoxizität" und „antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität" 16
1.5. Das Prinzip der Durchflusszytometrie 19
1.5.1 Probenzuführung 19
1.5.2. Die Messung der Lichtstreuung 20
1.5.3. Die Messung der Fluoreszenz 20
1.5.4. Die Signalverarbeitung 21
1.5.5. Die Datenauswertung 21
1.6. Testverfahren zur Bestimmung der zytotoxischen Aktivität der NK 23
1.6.1. Chromium51 (Cr5') Freisetzungsverfahren 23
1.6.2. Durchflusszytometrische Methoden 26
2. Zielsetzung 26
3. Materialien und Methoden 27
3.1. Materialien 27
3.1.1. Geräte 27
3.1.2. Verbrauchsmaterialien 27
3.1.3. Zelllinien und Medien 28
3.1.4. Chemikalien und Reagenzien 28
3.1.5. Antikörper und Fluoreszenzfarbstoffe 29
3.1.6. Computer und Software 29
3.2. Vorbereitungen 30
3.2.1. Kultivierung der Targetzellen P815 30
3.2.2. Immunisierung von Kaninchen mit P815 30
3.2.3. Hitzeinaktivierung des Kaninchenserums 31
3.3. Testverfahren zur Bestimmung der ADCC 31
3.3.1. Blutentnahme 31
3.3.2. Bestimmung der Konzentration der PMNC im Blut 31
3.3.3. Gewinnung und Verarbeitung der PMNC aus dem Blut 32
3.3.4. Einstellung der Konzentration der NK auf 100 Zellen/ul 33
3.3.5. Gewinnung und Verarbeitung der Targetzellen P815 33
3.3.6. Testansätze 35
3.3.7. Durchflusszytometrische Analyse 35
3.3.8. Auswertung der Messungen mit „Cell Quest" 36
3.4. Testvariationen des ADCC 39
3.4.1. Elimination der Monozyten mit Hilfe von anti-CD 14-Magnetbeads 39
3.4.2. Generierung von „Lymphokin-aktivierten Killerzellen" (LAK) 41
3.4.3. Komplement-vermittelte Lyse von P815 41
3.5. Patienten, Kontrollgruppe und Probanden 42
4. Ergebnisse 44
4.1. Einfluss von Komplement im Kaninchenserum 44
4.2. Die Lyse von P815 ist unabhängig vom immunisierten Kaninchen 47
4.3. Abhängigkeit der ADCC von der Antiserumkonzentration 48
4.4. Abhängigkeit der ADCC vom Verhältnis der Effektor- zu den Targetzellen 51
4.5. Kinetik der ADCC 52
4.6. Einfluss der Monozyten auf die ADCC 54
4.7. Lyse von P815 durch „Lymphokin-aktivierte Killerzellen" 56
4.8. Laborinterne Qualitätssicherung 57
4.9. ADCC der Kontrollgruppe 59
4.10. Vergleich der Kontrollgruppe mit den Patientinnen 65
4.11. Vergleich der Patientinnen vor und nach operativer Intervention 69
5. Diskussion 73
5.1. Vergleich durchflusszytometrischer Methoden und Cr5' -Freisetzungsverfahren 73
5.2. Erarbeitung eines Testverfahrens zur Bestimmung der ADCC von NK 74
5.3. ADCC der Kontrollgruppe 79
5.4. Vergleich der Kontrollgruppe mit den Patientinnen 81
5.5. Vergleich der ADCC der Patientinnen vor und nach operativer Intervention 83
6. Anhang 85
7. Zusammenfassung 93
8. Literaturverzeichnis 96 |
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