Verfügbarkeit: Herstellung von Protein-Mikroarrays aus DNA-Mikroarrays sowie deren Anwendung für eine label-freie Screening Technologie

Herstellung von Protein-Mikroarrays aus DNA-Mikroarrays sowie deren Anwendung für eine label-freie Screening Technologie:

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser:	Herz, Tobias 1987- (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Buch
Sprache:	German
Veröffentlicht:	Freiburg im Breisgau November 2019
Schlagworte:	Microarray Proteine Screening Hochschulschrift
Online-Zugang:	Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis
Beschreibung:	IX, 165 Seiten Illustrationen, Diagramme 30 cm

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adam_text	IV INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG ............................................................................................................................................................... 1 1.1 PROTEIN-PROTEIN INTERAKTIONEN ....................................................................................................................... 1 1.2 PROTEIN-MIKROARRAYS .................................................................................................................................... 2 1.3 IN SITU PROTEIN-MIKROARRAYS .......................................................................................................................... 3 2 ZIELSETZUNG ............................................................................................................................................................. 4 3 STAND DER TECHNIK ................................................................................................................................................ 5 3.1 PROTEIN-MIKROARRAYS .................................................................................................................................... 5 3.1.1 PROTEIN-MIKROARRAYS UND DEREN ANWENDUNG ........................................................................................ 6 3.2 HERSTELLUNGSVERFAHREN VON PROTEIN-MIKROARRAYS ....................................................................................... 8 3.3 IN SITU PROTEIN-MIKROARRAYS ....................................................................................................................... 10 3.3.1 UEBERSICHT DER IN SITU PROTEIN-MIKROARRAY HERSTELLUNGSVERFAHREN ...................................................... 10 3.4 PROTEIN MICROARRAY COPYING (PMAC) IM DETAIL ...................................................................................... 14 3.4.1 PDITC-OBERFLAECHENBESCHICHTUNG ZUR DNA-IMMOBILISIERUNG .......................................................... 16 3.4.2 LINEARE TEMPLATE-DNA ........................................................................................................................ 16 3.4.3 HIS-TAG UND N INT A-OBERFLAECHEN ....................................................................................................... 17 3.4.4 HALOTAG UND HALOBIND-OBERFLAECHEN ................................................................................................... 17 3.5 DETEKTION VON PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTION ............................................................................................... 18 3.5.1 FLUORESZENZ-MARKIERUNG ....................................................................................................................... 18 3.5.2 LABEL-FREIE MESSVERFAHREN .................................................................................................................... 19 3.5.3 SCORE-MESSVERFAHREN ....................................................................................................................... 22 3.6 BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTE KD ........................................................................................... 23 3.6.1 REAKTIONSKINETIK VON GELOESTEN BINDUNGSPARTNERN ............................................................................... 23 3.6.2 REAKTIONSKINETIK VON IMMOBILISIERTEN LIGANDEN UND GELOESTEN ANALYTEN .......................................... 24 3.6.3 BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTE KD ...................................................................................... 25 3.7 DARPINS DESIGNED ANKYRIN REPEAT PROTEINS ......................................................................................... 27 3.8 RIBOSOMEN-DISPLAY ...................................................................................................................................29 4 MATERIAL UND METHODEN .................................................................................................................................... 30 4.1 MATERIALIENSAMMLUNG .................................................................................................................................30 4.1.1 GERAETE ..................................................................................................................................................... 30 4.1.2 SOFTWARE ................................................................................................................................................. 31 4.1.3 CHEMIKALIEN ................................................................................................. 31 4.1.4 ENZYME .................................................................................................................................................. 33 4.1.5 ANTIKOERPER ................................................................................................................................... 33 V 4.1.6 KITS UND WEITERE FUNKTIONSMATERIALIEN .................................................................................................34 4.1.7 ZELLLINIEN ................................................................................................................................................34 4.1.8 VEKTOREN ................................................................................................................................................ 34 4.1.9 DNA-SEQUENZEN ...................................................................................................................................37 4.1.10 OLIGONUKLEOTIDE ................................................................................................................................ 38 4.1.11 STANDARD-PUFFER ................................................................................................................................ 38 4.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN .............................................................................................................. 39 4.2.1 PLASMID-DESIGN ..................................................................................................................................... 39 4.2.2 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) ..................................................................... 39 4.2.3 RESTRIKTIONS-ENDONUKLEASEN (REN) VERDAU .......................................................................................40 4.2.4 DNA-LIGATION .......................................................................................................................................40 4.2.5 GIBSON ASSEMBLY .................................................................................................................................. 41 4.2.6 ZELLTRANSFORMATION ................................................................................................................................ 41 4.2.7 AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE .................................................................................................................. 41 4.2.8 POLYACRYLAMID GELELEKTROPHORESE UND WESTERN BLOT ........................................................................ 42 4.3 OBERFLAECHENCHEMIE .................................................................................................................................... 44 4.3.1 OBERFLAECHENAKTIVIERUNG DURCH PDITC BESCHICHTUNG ........................................................................ 44 4.3.2 HALOBIND GLAS-SLIDES ........................................................................................................................... 46 4.3.3 AKTIVIERUNG VON GLASOBJEKTTRAEGER MIT NINTA ................................................................................... 46 4.4 HERSTELLUNG VON PROTEIN-MIKROARRAYS ....................................................................................................... 47 4.4.1 PROTEIN IN SITU ARRAY (PISA) ................................................................................................................ 47 4.4.2 PMAC PROTEIN-MIKROARRAY-KOPIERER ............................................................................................... 48 4.4.3 PRODUKTION FLUSSZELLEN UND KAVITAETEN-CHIPS ..................................................................................... 49 4.4.4 DESIGN DER FLUSSZELLEN UND KAVITAETEN-CHIPS ...................................................................................... 50 4.4.5 HERSTELLUNG EINES DNA-MIKROARRAYS .................................................................................................. 50 4.4.6 BEFUELLUNG DER FLUSSZELLE MIT ZELL-FREIEM MIX ..................................................................................... 51 4.4.7 NACHWEIS DER EXPRESSIONSKONTROLLEN DURCH FLUORESZENZMIKROSKOPIE ............................................. 52 4.5 ANTI KOERPER-INKUBATION UND FLUORESZENZ-DETEKTION ................................................................................. 52 4.5.1 ANTIKOERPER-INKUBATION VIA SANDWICH-VERFAHREN ................................................................................ 52 4.5.2 FLUORESZENZ-DETEKTION ......................................................................................................................... 52 4.5.3 DEFINITION EINES PROTEINSPOTS UND KREUZKONTAMINATION PMAC ........................................................ 53 4.5.4 QUANTIFIZIERUNG DER SIGNAL INTENSITAETEN VON PROTEIN-SPOTS ................................................................ 53 4.6 EINFARBENREFLEKTOMETRIE (SINGLE COLOR REFLECTOMETRY, SCORE) .............................................................. 54 4.6.1 SCORE-SETUP UND BILDERKENNUNG .......................................................................................................54 4.6.2 ABLAUF EINER SCORE-DURCHFLUSSMESSUNG ......................................................................................... 55 4.6.3 SCORE FLUIDIK-PROTOKOLLE .................................................................................................................. 56 4.6.4 BILDVERARBEITUNG ................................................................................................................................... 57 4.7 DATENANALYSE MIT ANABEL ..................................................................................................................... 59 4.8 MULTIZYKLUSVERFAHREN ............................................................................................................................... 63 VI 4.9 RAUSCH-ANALYSE .......................................................................................................................................... 63 4.10 BERECHNUNG DES RATIOMETRISCHEN BINDEVERHAELTNIS VON KOPIERTEM PROTEIN ZU GEBUNDEN TARGET .......... 63 4.11 DN A-HYBRIDISIERUNG MIT FLUORESZENZ-SONDEN ........................................................................................ 65 5 ERGEBNISSE UND DISKUSSION ............................................................................................................................... 66 5.1.1 PLASMID-KONSTRUKTION ...........................................................................................................................66 5.1.2 LINEARISIERUNG DER DNA-TEMPLATES ....................................................................................................67 5.1.3 PROTEIN-EXPRESSION IM REAKTIONSGEFASS ............................................................................................... 67 5.1.4 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................................................ 69 5.2 PROTEINEXPRESSION AUF OBERFLAECHEN ............................................................................................................ 70 5.2.1 GFP-EXPRESSIONEN IN FLUSSZELLEN ......................................................................................................... 70 5.2.2 EXPRESSIONSDYNAMIK .............................................................................................................................. 71 5.2.3 VARIATION DER PRIMER FUER DIE OPTIMIERUNG DER DNA-EXPRESSION AUF OBERFLAECHEN .......................... 74 5.2.4 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................................................ 80 5.3 OPTIMIERUNG DES PROTOKOLLS DER PDITC-BESCHICHTUNG ........................................................................... 81 5.4 HALOBIND-OBERFLAECHEN .............................................................................................................................. 86 5.4.1 FUNKTIONSNACHWEIS DER HALOBIND-OBERFLAECHE ..................................................................................... 86 5.4.2 TEMPERATURABHAENGIGE BINDUNG AN HALOBIND OBERFLAECHEN ............................................................... 89 5.4.3 ZEITABHAENGIGKEIT DER IMMOBILISIERUNG ............................................................................................... 91 5.4.4 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................................................92 5.5 ETABLIERUNG DES PROTEIN-MIKROARRAY-KOPIER PROZESSES .......................................................................... 93 5.5.1 PROTEIN-KOPIEN AUS EINER DNA-VORLAGE ............................................................................................ 93 5.5.2 HALTBARKEIT DER DNA-ARRAYS ............................................................................................................... 95 5.5.3 QUALITATIVER VERGLEICH ZWISCHEN NINTA- UND HALOBIND-OBERFLAECHEN ........................................... 95 5.5.4 QUANTIFIZIERUNG DER FLUORESZENZSIGNALE .............................................................................................96 5.5.5 LABEL-FREIE DETEKTION DER ANTIKOERPERANBINDUNG AN KOPIERTE PROTEIN-MIKROARRAYS ..........................99 5.5.6 PMAC IN KAVITAETEN ............................................................................................................................. 100 5.5.7 ZUSAMMENFASSUNG .............................................................................................................................. 103 5.6 ANWENDUNGSORIENTIERTE LABEL-FREIE BINDUNGSMESSUNGEN ..................................................................... 105 5.6.1 BINDEVERSUCHE MIT GFP- UND MCHERRY-BINDENDEN DARPINS .......................................................... 105 5.6.2 BINDEVERSUCHE MIT GST-, TRAX- UND SUMO-BINDENDEN DARPINS ............................................... 108 5.7 HERSTELLUNG VON DARPIN-MIKROARRAYS ................................................................................................. 112 5.8 EINFLUSS DER ROI-AUSWAHL AUF DIE SCORE-MESSUNG ........................................................................... 113 5.8.1 RAUSCH-ANALYSE .................................................................................................................................. 113 5.8.2 EINFLUSS VON POSITION UND GROESSE DES ROI AUF DEN KD-WERT ........................................................... 114 5.8.3 ANALYSE DER BACKGROUND-WAHL .......................................................................................................... 118 5.8.4 ZUSAMMENFASSUNG .............................................................................................................................. 120 5.9 DARPIN-SCREENING .................................................................................................................................. 121 VII 5.9.1 REPRAESENTATIVE MESSKURVEN ............................................................................................................... 121 5.9.2 BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTE MIT EINER SINGLE CURVE ANALYSE ...................................... 126 5.9.3 KD-WERT BESTIMMUNG UEBER EIN MULTIZYKLUSVERFAHREN ..................................................................... 130 5.10 BARCODE-HYBRIDISIERUNG MIT FLUORESZENZ-SONDEN ................................................................................. 133 6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK ................................................................................................................... 135 6.1 ZUSAMMENFASSUNG ..................................................................................................................................... 135 CONCLUSION .............................................................................................................................................................. 137 6.2 AUSBLICK .................................................................................................................................................... 140 7 DANKSAGUNG ....................................................................................................................................................... 142 8 LITERATURVERZEICHNIS ......................................................................................................................................... 143 9 ANHANG ............................................................................................................................................................... 153 9.1 PDITC-SCREENING ...................................................................................................................................... 153 9.2 HALO-BIND ................................................................................................................................................. 154 9.2.1 TEMPERATURABHAENGIGKEIT DER IMMOBILISIERUNG ............................................................................ 154 9.2.2 ZEITABHAENGIGKEIT DER IMMOBILISIERUNG .............................................................................................. 155 9.3 ETABLIERUNG DES PMAC-PROZESSES 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adam_txt	IV INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG . 1 1.1 PROTEIN-PROTEIN INTERAKTIONEN . 1 1.2 PROTEIN-MIKROARRAYS . 2 1.3 IN SITU PROTEIN-MIKROARRAYS . 3 2 ZIELSETZUNG . 4 3 STAND DER TECHNIK . 5 3.1 PROTEIN-MIKROARRAYS . 5 3.1.1 PROTEIN-MIKROARRAYS UND DEREN ANWENDUNG . 6 3.2 HERSTELLUNGSVERFAHREN VON PROTEIN-MIKROARRAYS . 8 3.3 IN SITU PROTEIN-MIKROARRAYS . 10 3.3.1 UEBERSICHT DER IN SITU PROTEIN-MIKROARRAY HERSTELLUNGSVERFAHREN . 10 3.4 PROTEIN MICROARRAY COPYING (PMAC) IM DETAIL . 14 3.4.1 PDITC-OBERFLAECHENBESCHICHTUNG ZUR DNA-IMMOBILISIERUNG . 16 3.4.2 LINEARE TEMPLATE-DNA . 16 3.4.3 HIS-TAG UND N INT A-OBERFLAECHEN . 17 3.4.4 HALOTAG UND HALOBIND-OBERFLAECHEN . 17 3.5 DETEKTION VON PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTION . 18 3.5.1 FLUORESZENZ-MARKIERUNG . 18 3.5.2 LABEL-FREIE MESSVERFAHREN . 19 3.5.3 SCORE-MESSVERFAHREN . 22 3.6 BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTE KD . 23 3.6.1 REAKTIONSKINETIK VON GELOESTEN BINDUNGSPARTNERN . 23 3.6.2 REAKTIONSKINETIK VON IMMOBILISIERTEN LIGANDEN UND GELOESTEN ANALYTEN . 24 3.6.3 BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTE KD . 25 3.7 DARPINS DESIGNED ANKYRIN REPEAT PROTEINS . 27 3.8 RIBOSOMEN-DISPLAY .29 4 MATERIAL UND METHODEN . 30 4.1 MATERIALIENSAMMLUNG .30 4.1.1 GERAETE . 30 4.1.2 SOFTWARE . 31 4.1.3 CHEMIKALIEN . 31 4.1.4 ENZYME . 33 4.1.5 ANTIKOERPER . 33 V 4.1.6 KITS UND WEITERE FUNKTIONSMATERIALIEN .34 4.1.7 ZELLLINIEN .34 4.1.8 VEKTOREN . 34 4.1.9 DNA-SEQUENZEN .37 4.1.10 OLIGONUKLEOTIDE . 38 4.1.11 STANDARD-PUFFER . 38 4.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN . 39 4.2.1 PLASMID-DESIGN . 39 4.2.2 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) . 39 4.2.3 RESTRIKTIONS-ENDONUKLEASEN (REN) VERDAU .40 4.2.4 DNA-LIGATION .40 4.2.5 GIBSON ASSEMBLY . 41 4.2.6 ZELLTRANSFORMATION . 41 4.2.7 AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE . 41 4.2.8 POLYACRYLAMID GELELEKTROPHORESE UND WESTERN BLOT . 42 4.3 OBERFLAECHENCHEMIE . 44 4.3.1 OBERFLAECHENAKTIVIERUNG DURCH PDITC BESCHICHTUNG . 44 4.3.2 HALOBIND GLAS-SLIDES . 46 4.3.3 AKTIVIERUNG VON GLASOBJEKTTRAEGER MIT NINTA . 46 4.4 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RAUSCH-ANALYSE . 63 4.10 BERECHNUNG DES RATIOMETRISCHEN BINDEVERHAELTNIS VON KOPIERTEM PROTEIN ZU GEBUNDEN TARGET . 63 4.11 DN A-HYBRIDISIERUNG MIT FLUORESZENZ-SONDEN . 65 5 ERGEBNISSE UND DISKUSSION . 66 5.1.1 PLASMID-KONSTRUKTION .66 5.1.2 LINEARISIERUNG DER DNA-TEMPLATES .67 5.1.3 PROTEIN-EXPRESSION IM REAKTIONSGEFASS . 67 5.1.4 ZUSAMMENFASSUNG . 69 5.2 PROTEINEXPRESSION AUF OBERFLAECHEN . 70 5.2.1 GFP-EXPRESSIONEN IN FLUSSZELLEN . 70 5.2.2 EXPRESSIONSDYNAMIK . 71 5.2.3 VARIATION DER PRIMER FUER DIE OPTIMIERUNG DER DNA-EXPRESSION AUF OBERFLAECHEN . 74 5.2.4 ZUSAMMENFASSUNG . 80 5.3 OPTIMIERUNG DES PROTOKOLLS DER PDITC-BESCHICHTUNG . 81 5.4 HALOBIND-OBERFLAECHEN . 86 5.4.1 FUNKTIONSNACHWEIS DER HALOBIND-OBERFLAECHE . 86 5.4.2 TEMPERATURABHAENGIGE BINDUNG AN HALOBIND OBERFLAECHEN . 89 5.4.3 ZEITABHAENGIGKEIT DER IMMOBILISIERUNG . 91 5.4.4 ZUSAMMENFASSUNG .92 5.5 ETABLIERUNG DES PROTEIN-MIKROARRAY-KOPIER PROZESSES . 93 5.5.1 PROTEIN-KOPIEN AUS EINER DNA-VORLAGE . 93 5.5.2 HALTBARKEIT DER DNA-ARRAYS . 95 5.5.3 QUALITATIVER VERGLEICH ZWISCHEN NINTA- UND HALOBIND-OBERFLAECHEN . 95 5.5.4 QUANTIFIZIERUNG DER FLUORESZENZSIGNALE .96 5.5.5 LABEL-FREIE DETEKTION DER ANTIKOERPERANBINDUNG AN KOPIERTE PROTEIN-MIKROARRAYS .99 5.5.6 PMAC IN KAVITAETEN . 100 5.5.7 ZUSAMMENFASSUNG . 103 5.6 ANWENDUNGSORIENTIERTE LABEL-FREIE BINDUNGSMESSUNGEN . 105 5.6.1 BINDEVERSUCHE MIT GFP- UND MCHERRY-BINDENDEN DARPINS . 105 5.6.2 BINDEVERSUCHE MIT GST-, TRAX- UND SUMO-BINDENDEN DARPINS . 108 5.7 HERSTELLUNG VON DARPIN-MIKROARRAYS . 112 5.8 EINFLUSS DER ROI-AUSWAHL AUF DIE SCORE-MESSUNG . 113 5.8.1 RAUSCH-ANALYSE . 113 5.8.2 EINFLUSS VON POSITION UND GROESSE DES ROI AUF DEN KD-WERT . 114 5.8.3 ANALYSE DER BACKGROUND-WAHL . 118 5.8.4 ZUSAMMENFASSUNG . 120 5.9 DARPIN-SCREENING . 121 VII 5.9.1 REPRAESENTATIVE MESSKURVEN . 121 5.9.2 BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTE MIT EINER SINGLE CURVE ANALYSE . 126 5.9.3 KD-WERT BESTIMMUNG UEBER EIN MULTIZYKLUSVERFAHREN . 130 5.10 BARCODE-HYBRIDISIERUNG MIT FLUORESZENZ-SONDEN . 133 6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK . 135 6.1 ZUSAMMENFASSUNG . 135 CONCLUSION . 137 6.2 AUSBLICK . 140 7 DANKSAGUNG . 142 8 LITERATURVERZEICHNIS . 143 9 ANHANG . 153 9.1 PDITC-SCREENING . 153 9.2 HALO-BIND . 154 9.2.1 TEMPERATURABHAENGIGKEIT DER IMMOBILISIERUNG . 154 9.2.2 ZEITABHAENGIGKEIT DER IMMOBILISIERUNG . 155 9.3 ETABLIERUNG DES PMAC-PROZESSES . 155 9.3.1 MEHRFACHE KOPIE . 155 9.3.2 QUANTIFIZIERUNG DER MENGE AN GEBUNDENEM PROTEIN . 156 9.3.3 GROESSENBERECHNUNG DER DNA-TROEPFCHEN . 156 9.3.4 VOLLSTAENDIGE QUANTIFIZIERUNG ALLER KOPIEN AUS 5.5.4 . 157 9.4 DETAILLIERTE FLUIDIK-PROTOKOLLE . 159 9.5 EXEMPLARISCHE ERGEBNISSTABELLE EINER KD BERECHNUNG . 162 9.6 QUELLENVERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN . 164
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