Identifizierung und Charakterisierung des SC-1-Apoptose-Rezeptors:
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 DER SC-1 ANTIKOERPER 2
1.2 KREBSERKRANKUNGEN DES MAGENS ' 2
1.3 THERAPIE DES MAGENKARZINOMS 5
1.4 APOPTOSE 6
1.4.1 MORPHOLOGISCHE ASPEKTE DER APOPTOSE 7
1.4.2 BIOCHEMISCHE ASPEKTE DER APOPTOSE 7
1.4.3 APOPTOSE VERMITTELNDE REZEPTOREN 9
1.4.4 PROTEINPHOSPHORYLIERUNG - REGULATION IN DER APOPTOSE 11
1.5 ZIEL DER ARBEIT 14
2 MATERIAL UND METHODEN 15
2.1 MATERIAL ' 15
2.1.1 CHEMIKALIEN UND VERWENDETE VERBRAUCHSMITTEL 15
2.1.2 VERWENDETE ZELLINIEN 17
2.1.3 VERWENDETE BAKTERIENSTAEMME 17
2.1.4 GERAETE 17
2.1.5 HAEUFIG BENUTZTE MEDIEN, LOESUNGEN, PUFFER 18
2.1.6 SOFT-UND HARDWARE: 21
2.2 METHODEN DER MIKRO- UND ZELLBIOLOGIE 22
2.2.1 ZELLKULTUR 22
2.2.2 ESCHERICHIA COLI BAKTERIENKULTUR 22
2.2.3 PROLIFERATIONS-TEST (MTT-ASSAY) 23
2.2.4 CELL DEATH ELISAPLUS (ROCHE, MANNHEIM) 23
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.2.5 HERSTELLUNG MONOKLONALER MAUS ANTIKOERPER 24
2.2.6 SPALTUNG DES GPI-ANKERS MIT PHOSPHATIDYLINOSIT-SPEZIFISCHE
PHOSPHOLIPASE C (PIPLC) 24
2.2.7 PHOSPHORYLIERUNGSSTUDIEN 25
2.3 METHODEN DER BIOCHEMIE 25
2.3.1 PRAEPARATION VON GESAMTZELLPROTEINEXTRAKTEN AUES ZELLINIEN 25
2.3.2 PRAEPARATION VON MEMBRANPROTEINEXTRAKTEN AUS ZELLINIEN 26
2.3.3 PRAEPARATION VON ZELLKEMEXTRAKTEN AUS ZELLINIEN 26
2.3.4 ACETONFAELLUNG VON PROTEINEN 26
2.3.5 PROTEINBESTIMMUNG 27
2.3.5.1 QUANTIFIZIERUNG NACH BRADFORD 27
2.3.5.2 QUANTIFIZIERUNG MITTELS BCA-ASSAY 27
2.3.6 NATRIUM-DODECYLSULFAT-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 27
2.3.6.1 LAUFBEDINGUNGEN 28
2.3.7 COOMASSIEFAERBUNG 28
2.3.8 WESTEM-TRANSFER-BLOT (SEMI-DRY BLOT) 29
2.3.8.1 IMMUNODETEKTION 29
2.3.8.2 GELFILTRATION 29
2.3.8.3 ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE (AAC) 30
2.3.8.4 KATIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE (KAC) 30
2.3.9 PROTEINSEQUENZIERUNG 31
2.4 METHODEN DER MOLEKULARBIOLOGIE 31
2.4.1 IMMUNOSCREEN 31
2.4.1.1 TITERBESTIMMUNG DER PHAGEN-CDNA-BANK 31
2.4.2 AMPLIFIZIERUNG DER CDNA-BANK 32
2.4.2.1 1-SCREEN 32
2.4.2.2 ANTIKOERPERDETEKTION 33
2.4.2.3 2-SCREEN 33
2.4.2.4 3-SCREEN 34
2.4.2.5 AUSSCHLEUSEN DER POSITIVEN PHAGEN-DNA 34
2.4.3 RADIOAKTIVE MARKIERUNG EINER DNA-SONDE 35
2.4.4 REINIGUNG DER MARKIERTEN DNA-SONDE MIT QUICK SPINTM COLUMNS 35
2.4.5 BESTIMMUNG DER SPEZIFISCHEN AKTIVITAET [A-32P] 35
2.4.6 SCREEN MIT RADIOAKTIV MARKIERTER DNA-SONDE 36
2.4.7 MINI-PLASMID-ISOLIERUNG (BIRNBOIM & DOLY, 1979) 36
2.4.8 MAXI-PLASMID-ISOLIERUNG 37
2.4.9 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 37
2.4.10 DNA-SEQUENZIERUNG 37
2.4.11 SEQUENZDATEN-ANALYSE ' 38
2.4.12 PRIMER-SEQUENZEN 39
2.4.13 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 39
2.4.14 RNA-ISOLIERUNG 40
2.4.15 RNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 40
2.4.16 REVERSE TRANSKRIPTION 41
2.4.17 KLONIERUNG EINES PCR-FRAGMENTS 41
2.4.18 RESTRIKTIONSANALYSE 41
2.5 METHODEN DER IMMUNHISTOCHEMIE 41
2.5.1 PRAEPARATION VON ZYTOSPINS 41
2.5.2 ENZYMATISCHER VERDAU VON PROTEINEN AUF ZYTOSPINS 42
2.5.2.1 N-GLYCOSIDISCHER-VERDAU 42
2.5.2.2 O-GLYCOSIDISCHER VERDAU 42
2.5.3 IMMUNHISTOCHEMISCHE FAERBUNG VON ZYTOSPINS UND PARAFFIN-SCHNITTEN
42
3 ERGEBNISSE 44
3.1 IMMUNOSCREEN
/ 44
3.2 WESTERN-BLOT ANALYSEN MIT SC-1 ALS PRIMAERANTIKOERPER 45
3.3 AUFREINIGUNG DES SC-1 ANTIGENS 47
3.3.1 GELFILTRATION 47
3.3.2 ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE 48
3.4 SEQUENZIERUNG DER SC-1 POSITIVEN BANDEN
51
3.5 MONOKLONALE MAUS AK 53
3.6 CHARAKTERISIERUNG DES SC-1 ANTIGENS 56
3.6.1 MUTATIONSANALYSEN 56
3.6.1.1 CDNA-BANK SCREEN 56
3.6.1.2 PCR-AMPLIFIKATION VON CD55-FRAGMENTEN 58
3.6.2 PHOSPHOLIPASE VERDAU 61
3.6.3 GLYCOSIDASE-VERDAU ' 62
3.7 SIGNALTRANSDUKTIONSEXPERIMENTE 63
3.7.1 EINFLUSS DER SC-1 APOPTOSE INDUKTION AUF DIE PARP AKTIVITAET 63
3.7.2 PHOSPHORYLIERUNGSSTUDIEN 64
3.7.2.1 REINIGUNG DER PROTEINE P37 UND P35 AUS
23132-MAGENKARZINOMZELLEN 67
3.7.2.2 SEQUENZIERUNG DER PROTEINE P35 UND P37 71
3.7.2.3 IMMUNODETEKTION MIT HNRNP AL SPEZIFISCHEN AK 72
3.7.3 AKTIVIERUNGS- UND INHIBITIONSSTUDIEN 74
3.7.3.1 INHIBITOREN FUER TYROSINPHOSPHORYLIERUNG 75
3.7.3.2 INHIBITION DER PROTEIN KINASE C (PKC) 76
3.7.3.3 AKTIVIERUNG VON INTRAZELLULAEREM CALCIUM 79
3.7.3.4 INHIBITION VON SRC-KINASEN 80
3.7.3.5 HEMMUNG DER PHOSPHOLIPASE C 81
4 DISKUSSION 83
4.1 WESTERN-BLOT ANALYSE ' 84
4.2 DATEN DER PROTEINSEQUENZIERUNG 85
4.3 CD55 - DER POTENZIELLE SC-1 APOPTOSE-REZEPTOR ? 86
4.3.1 PHYSIOLOGISCH - BIOCHEMISCHE AKTIVITAET DES SC-1 ANTIGENS UND CD55
86
4.3.2 SC-1 REZEPTOR, EIN N-GLYCOSYLIERTES, GPI-VERANKERTES MOLEKUEL 87
4.3.3 VERTEILUNG VON CD55 89
4.3.4 SC-1 VERMITTELTE TRANSDUKTIONSKASKADE: DIE UNTERSCHIEDLICHEN
ROLLEN
DER PTK, PKC UND PLC 91
4.3.5 SC-1 INDUKTION INDUZIERT KEINE SPALTUNG VON PARP 94
4.3.6 SERIN DEPHOSPHORYLIERUNG - SC-1 INDUZIERTE AKTIVIERUNG VON SERIN-
PHOSPHATASEN? 94
5 ZUSAMMENFASSUNG 97
6 SUMMARY 99
7 LITERATURVERZEICHNIS 101
7.1 VERWENDETE LITERATUR 101
7.2 VEROEFFENTLICHUNGEN, VORTRAEGE, ABSTRACTS 117
7.2.1 VEROEFFENTLICHUNGEN 117
7.2.2 ABSTRACTS, VORTRAEGE 118
8 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 121 |
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