Die Rolle der cAMP-Bindungsstelle der S-Adenosylhomocysteinhydrolase bei der Regulation der Enzymaktivität:
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Autor: Hagen, Norbert
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis der Abkürzungen 3
1 Einleitung 7
1.1 Bisheriger Kenntnisstand 7
1.2 Eigene Fragestellung 20
2 Untersuchungsgut und Methoden 21
2.1 Enzym SAH-Hydrolase 21
2.1.2 Überprüfung der Reinheit des Enzyms 22
2.1.3 Messung der Enzymaktivität 22
2.1.6 Herstellung des Apoenzyms und Rekonstitution der SAH-Hydrolase mit
NAD+ 24
2.1.7 Markierung der SAH-Hydrolase mit 8-Azido-cAMP und 8-Azido-Adenosin
25
2.2 Der Radioligand 3H-cAMP 26
2.3 Theoretische Grundlagen 28
2.3.1 Prinzip der spezifischen Bindung 28
2.3.2. Hemmungsexperimente mit Kompetitoren 30
2.3.3 Filtrationsapparatur 34
2.3.4 Filter 35
2.4 Untersuchte cAMP-Analoga 36
2.4.1 cAMP-Analoga mit Modifikationen am Adenin 37
2.4.2 cAMP-Analogon mit Modifikation an der Ribose 38
2.4.3 cAMP-Analogon mit Modifikation am Adenin und an der Ribose 39
2.4.4 Weitere Substanzen 40
2.5 Spektrophotometrische Titration 41
2.6 Berechnung der Daten 41
3 Ergebnisse 43
3.1 Messung der Enzymaktivität 43
3.1.1 Enzymkinetik in Anwesenheit von cAMP 43
3.1.3 Enzymkinetik mit 2-MB-cAMP 46
3.1.4 Enzymkinetik mit db-cAMP 47
I
Inhaltsverzeichnis
3.1.5 Enzymkinetik mit AMP, ADP, ATP und EGCG 48
3.1.6 Aktivität der SAH-Hydrolase in ihrer NAD* -Form 55
3.1.7 Enzymaktivität der mit 8-Azido-cAMP und Azido-Ado markierten SAH-
Hydrolase 58
3.2 Bindungsstudien mit 3H-cAMP 60
3.2.1 cAMP-Analoga mit Modifikationen am Adenin 60
3.2.2 cAMP-Analogon mit Veränderung an der Ribose 63
3.2.3 cAMP-Analogon mit Modifikation am Adenin und an der Ribose 64
3.2.4 Bindungsstudien mit anderen Kompetitoren 65
3.3 Bindungsstudien mit 8-Azido-cAMP und Azido-Ado markierter SAH-
Hydrolase 66
3.4. Spektrophotometrische Titration der SAH-Hydrolase 69
4 Diskussion 71
4.1 Enzymkinetiken 72
4.2 Bindungsstudien mit 3H-cAMP 76
4.3 Spektrophotometrische Titration 79
5 Zusammenfassung 80
6 Literaturverzeichnis 81
2
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