Kristallographische und biochemische Charakterisierung des Golgi-assoziierten Proteins GRASP65 und seines Hefehomologen Grh1:
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
SELBSTSTAENDIGKEITSERKLAERUNG III
INHALTSVERZEICHNIS IV
ABBILDUNGSVERZEICHNIS VIII
TABELLENVERZEICHNIS X
ZUSAMMENFASSUNG XI
ABSTRACT XIII
1 EINLEITUNG 1
1.1 INTRAZELLULAERER VESIKELTRANSPORT 1
1.1.1 CLATHRIN 3
1.1.2 COP- VESIKELH UELLEN 3
1.1.3 COPII 3
1.1.4 COPI 4
1.1.5 ANHEFTUNGSFAKTOREN (TETHERING FACTORS) 4
1.1.6 COILED-COIL ANHEFTUNGSFAKTOREN 5
1.1.7 ANHEFTUNGSKOMPLEXE (MULTI-SUBUNIT TETHERING COMPLEXES) 5
1.1.8 MEMBRANFUSION VERMITTELT DURCH SNARES 7
1 . 2 G O L G I - A P P A R A T 8
1.2.1 GOLGINE - COILED-COIL PROTEINE AM GOLGI-APPARAT 10
1.2.1.1 GM130 - EIN GOLGIN AM C/S-GOLGI-APPARAT 11
1.2.1.2 BUG1 - DAS HEFEHOMOLOG ZU GM130 12
1.2.2 GRASP-PROTEINE 12
1.2.2.1 DOMAENENARCHITEKTUR DER GRASP-PROTEINE 13
1.2.2.2 ROLLE DER GRASP-PROTEINE IM AUFBAU DES GOLGI-APPARATES 14
1.2.2.3 GRASP65 15
1.2.2.4 GRASP55 16
1.2.2.5 GRH1 17
1 . 3 P D Z - D O M AE N E N 1 8
1.3.1 VORKOMMEN 18
1.3.2 PROTEINE MIT PDZ-DOMAENEN 19
1.3.3 LIGANDENBINDUNG 21
IV
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
1.3.4 KRANKHEITSRELEVANTE MUTANTEN 21
1 . 4 ZIELSTELLUNG DER A R B E I T 2 2
2 MATERIAL 23
2.1 GERAETE 2 3
2 . 2 CHEMIKALIEN UND KITS 2 4
2 . 2 . 1 CHEMIKALIEN 24
2.2.2 KITS 25
2.3 BAKTERIENSTAEMME UND CDNS 25
2.3.1 STAEMME 2 5
2.3.2 CDNS 2 5
2 . 4 PRIMER 2 6
2 . 4 . / PRIMER FUER KLONIERUNG GRASP65 26
2.4.2 PRIMER FUER MUTAGENESE GRASP65 26
2.4.3 PRIMER FUER KLONIERUNG GRH1 27
2 . 5 PEPTIDE 2 7
2 . 6 NAEHRMEDIEN UND LOESUNGEN 2 8
2.6.1 NAEHRMEDIEN 28
2.6.2 LOESUNGEN 29
2.6.2.1 MOLEKULARBIOLOGIE 29
2.6.2.2 PROTEINREINIGUNG 29
2.6.2.3 INTERAKTIONSSTUDIEN - ITC 30
2.6.2.4 SDS-PAGE 30
3 METHODEN 32
3.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE M E T H O D E N 3 2
3.1.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION 32
3.1.2 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 33
3.1.3 REINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN 3 3
3.1.4 BESTIMMUNG DER DNS-KONZENTRATION 34
3.1.5 LIGATIONSUNABHAENGIGE KLONIERUNG 34
3.1.6 TRANSFORMATION CHEMOKOMPETENTER E. COLI-ZELLEN 34
3.1.7 PLASMID-PRAEPARATION 34
3.1.8 MUTAGENESE 3 5
3.1.9 DNS-SEQUENZIERUNG 36
3.1.10 KONSTRUKTE 36
3 . 2 PROTEINREINIGUNG 3 8
V
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.1 EXPRESSION IN ESCHERICHIA COLI 38
3.2.2 ZELLAUFSCHLUSS 38
3.2.3 PROTEINREINIGUNG DURCH NICKEL-NITRILOTRIACETAT AGAROSE (NI-NTA) 38
3.2.4 GROESSENAUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE 39
3 . 3 PROTEINCHARAKTERISIERUNG 4 0
3.3.1 SDS-PAGE 40
3.3.2 PROTEINKONZENTRATION 40
3.3.3 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 41
3.3.4 MASSENSPEKTROMETRIE 41
3.3.5 STATISCHE LICHTSTREUUNG 42
3.3.6 ISOTHERME TITRATIONSKALORIMETRIE (ITC) 43
3.3.7 CIRCULARDICHROISMUS 45
3 . 4 KRISTALLOGRAPHISCHE M E T H O D E N 4 6
3.4.1 METHODE DER PROTEINKRISTALLISATION 46
3.4.2 DURCHFUEHRUNG KRISTALLISATION 48
3.4.3 ROENTGENBEUGUNGSEXPERIMENT 48
3.4.4 PHASENBESTIMMUNG UND BERECHNUNG DER ELEKTRONENDICHTE 51
3.4.5 ANOMALE DIFFRAKTION 5 2
3.4.6 MOLEKULARER ERSATZ (MR) 54
3.4.7 MODELLBAU UND STRUKTURVERFEINERUNG 5 5
3 . 5 ERSTELLUNG DES BINDUNGSMODELLS VON G R A S P 6 5 UND G M 1 3 0 5 6
4 ERGEBNISSE 57
4.1 STRUKTUREN DER P D Z - D O M AE N E N G R A S P 6 5 P D Z 1 U N D G R
A S P 6 5 P D Z 2 DES G O L G I ASSOZIIERTEN PROTEINS G R A S P 6 5 5 7
4.1.1 REKOMBINANTE EXPRESSION UND REINIGUNG 5 7
4.1.2 KRISTALLISATION ,VON GRASP65 PDZ1 UND GRASP65 PDZ2 61
4.1.3 DATENSAMMLUNG, STRUKTURBESTIMMUNG UND STRUKTURVERFEINERUNG 62
4.1.4 KRISTALLSTRUKTUR VON GRASP65 PDZ1 65
4.1.5 KRISTALLSTRUKTUR VON GRASP65 PDZ2 66
4.1.6 VERGLEICH VON GRASP65 PDZ1 UND GRASP65 PDZ2 68
4.1.7 DIMERISIERUNG VON GRASP65 PDZ1 UND GRASP65 PDZ2 69
4.1.8 DIE GRASP-DOMAENE 71
4 . 2 GRH1 - G R A S P 6 5 HOMOLOGES PROTEIN 1 AUS S . CEREVISIAE 7 4
4.2.1 REKOMBINANTE EXPRESSION UND REINIGUNG 74
4.2.2 KRISTALLISATION VON GRH 1 PD71A ^ B 76
V I
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.3 DATENSAMMLUNG UND STRUKTURBESTIMMUNG 7 7
4.2.4 KRISTALLSTRUKTUR DER ERSTEN PDZ-DOMAENE VON GRH 1 80
4.2.5 DIMERISIERUNG VON GRH 1 PDZ1A^B 83
4 . 3 INTERAKTIONSSTUDIEN 8 4
4.3.1 INTERAKTION VON GRASP65-KONSTRUKTEN MIT GM130-PEPTIDEN 84
4.3.1 INTERAKTION VON GRH1 MIT BUG1- BZW. USO1-PEPTIDEN 89
5 DISKUSSION 91
5.1 STRUKTURANALYSE 9 1
5.1.1 STRUKTUREN VON GRASP65 91
5.1.2 STRUKTUR VON GRH 1 PDZ1ASSB 91
5.1.3 PDZ-DOMAENEN IM VERGLEICH 92
5 . 2 M O D E L L DER BINDUNG VON G R A S P 6 5 AN DAS G O L G I N G M 1
3 0 9 5
5 . 3 BIOCHEMISCHE A N A L Y S E VON G R H 1 1 0 0
6 SCHLUSSFOLGERUNG 101
7 LITERATURVERZEICHNIS 102
ANHANG A
A . ABKUERZUNGSVERZEICHNIS A
B . DANKSAGUNG D
C . LEBENSLAUF E
V I I
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