Untersuchungen zur Rolle der Tyrosinkinase NPM-ALK in der Pathophysiologie maligner Lymphome:
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1997
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INHALTSANGABE
I
INHALTSANGABE
1. EINLEITUNG 1
1.1 HODGKIN- UND NICHT-HODGKIN-LYMPHOME 1
1.2 DER CYTOKINREZEPTOR CD30 3
1.3 DIE TYROSINKINASE NPM-ALK
7
1.4 RIBOZYME ALS THERAPEUTISCHER WIRKSTOFF
12
1.5 AUFGABENSTELLUNG 13
2. MATERIAL UND METHODEN
15
2.1 MATERIAL 1
5
2.1.1 STANDARD-CHEMIKALIEN 15
2.1.2 ENZYME
16
2.1.3 RESTRIKTIONSENZYME 15
2.1.4 ANTIKOERPER 15
2.1.5 KITS
17
2.1.6 KULTURMEDIEN 17
2.1.7 GROESSENSTANDARDS 17
2.1.8 RADIOCHEMIKALIEN 17
2.1.9 ZELL-LINIEN 18
2.1.10 VEKTOREN 18
2.1.11 DNA-KONSTRUKTE 18
2.1.12 PCR-PRIMER 18
2.1.13 STANDARD-GERAETE 19
2.2 STANDARD-LOESUNGEN UND STANDARD-PUFFER 19
2.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE STANDARD-METHODEN 22
2.3.1 GELELEKTROPHORESE VON DNA UND RNA 22
2.3.1.1 AGAROSE-GELE 22
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSANGABE
.U_
2.3.1.2 NATIVE POLYACRYLAMID-GELE 22
2.3.1.3 DENATURIERENDE POLYACRYLAMID-GELE 23
2.3.2 LAENGENSTANDARDS FUER DNA- UND RNA-FRAGMENTE 24
2.3.3 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 24
2.3.3.1 PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA UND RNA 24
2.3.3.2 DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG IN AGAROSE-GELEN 24
2.3.4 HYBRIDISIERUNG VON KOMPLEMENTAEREN OLIGONUKLEOTIDEN 25
2.3.5 DNASE VERDAU IN DNA/RNA-GEMISCHEN 25
2.3.6 RESTRIKTION VON DNA 25
2.3.7 AUFFUELLEN VON UEBERHAENGENDEN DNA-ENDEN NACH
RESTRIKTIONSVERDAU 26
2.3.8 PRAEPARATION VON NUKLEINSAEURE-FRAGMENTEN 26
2.3.8.1 DNA-EXTRAKTION AUS AGAROSE-GELEN 26
2.3.8.2 RNA-EXTRAKTION AUS POLYACRYLAMID-GELEN 26
2.3.8.3 PRAEPARATION VON NUKLEINSAEUREN MIT SEPHAROSE-SAEULEN 27
2.3.8.4 PRAEPARATION VON DNA MIT YYNUKLEOTID REMOVAL KIT" 27
2.3.8.5 PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION VON DNA 27
2.3.8.6 PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION VON RNA 28
2.3.9 FAELLUNG VON NUKLEINSAEUREN IN WAESSRIGEN LOESUNGEN 28
2.3.9.1 FAELLUNG VON DNA MIT ETHANOL 28
2.3.9.2 FAELLUNG VON DNA MIT ISOPROPANOL 28
2.3.9.3 FAELLUNG VON RNA MIT AMMONIUMACETAT 29
2.3.10 5'-DEPHOSPHORYLIERUNG LINEARISIERTER PLASMID-DNA 29
2.3.11 LIGATION VON DNA 29
2.3.12 TRANSFORMATION VON PLASMID-DNA IN BAKTERIEN 30
2.3.12.1 HERSTELLUNG VON TRANSFORMATIONSKOMPETENTEN BAKTERIEN 30
2.3.12.2 TRANSFORMATION VON KOMPETENTEN BAKTERIEN 30
2.3.13 BAKTERIENKULTUR 31
2.3.13.1 KULTIVIERUNG VON BAKTERIEN 31
2.3.13.2 DAUERKULTUR VON BAKTERIEN 31
2.3.14 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS TRANSFORMIERTEN BAKTERIEN 31
2.3.14.1 MINI-PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 31
2.3.14.2 GIGA-, MAXI-, UND MEDI-PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 32
INHALTSANGABE
_
UL
2.3.15 PRAEPARATIVE PCR-AMPLIFIKATION VON DNA-SEQUENZEN 32
2.3.16 ANALYTISCHE RT-PCR 33
2.3.16.1 PRAEPARATION VON GESAMT-RNA 33
2.3.16.2 CDNA-SYNTHESE VON POLY-A-RNA 33
2.3.16.3 ANALYTISCHE PCR 34
2.3.17 DNA-SEQUENZIERUNG 34
2.4 ZELLKULTUR 35
2.4.1 KULTIVIERUNG DER ZELL-LINIEN 35
2.4.2 DAUERKULTUREN 36
2.4.3 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 36
2.4.4 ZELL-STIMULATION MIT ANTI CD30-LGG 36
2.4.5 ZELL-ADHAERIERUNG MIT ANTI CD25-LGG 37
2.4.6 INHIBITION VON PHOSPHATASEN 37
2.4.7 TRANSIENTE TRANSFEKTION 38
2.4.7.1 TRANSFEKTION VON MODIFIZIERTEM ANTI NPM-ALK-RIBOZYM IN
KARPAS 299 ZELLEN 38
2.4.7.2 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON PLASMID-DNA IN 293-ZELLEN 39
2.4.8 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON PROTEINEN (YYPULSE CHASE") 39
2.5 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 41
2.5.1 HERSTELLUNG VON ZELL-LYSATEN 41
2.5.2 SDS-POLYACRYLAMID GEL-ELEKTROPHORESE 41
2.5.3 COOMASSIEFAERBUNG VON SDS-GELEN 42
2.5.4 WESTERN BLOT ANALYSE 42
2.5.4.1 TRANSFER DURCH SEMIDRY BLOTTING 42
2.5.4.2 AMIDOSCHWARZ-FAERBUNG DER TRANSFERMEMBRAN 43
2.5.4.3 PONCEAU S-FAERBUNG DER TRANSFERMEMBRAN 44
2.5.4.4 ANTIKOERPER-MARKIERUNG DER TRANSFERMEMBRAN 44
2.5.5 ENTFERNEN VON ANTIKOERPERN VON DER TRANSFERMEMBRAN 45
2.5.6 IMMUNPRAEZIPITATION VON PROTEINEN 46
2.5.7
IN VITRO TRANSLATION 47
2.5.8 UNTERSUCHUNG VON GST-FUSIONSPROTEINEN 47
2.5.8.1 INDUKTION VON GST-FUSIONSPROTEINEN IN E. COLI 47
INHALTSANGABE
IV
2.5.8.2 PRAEPARATION VON GST-FUSIONSPROTEINEN 48
2.5.8.3 BINDUNGSASSAYS MIT GST-FUSIONSPROTEINEN 49
2.6 SYNTHESE VON RNA 51
2.6.1
IN VITRO TRANSKRIPTION VON PLASMID-DNA 51
2.6.2
IN VITRO TRANSKRIPTION VON DOPPELSTRAENGIGEN OLIGONUKLEOTIDEN 52
2.6.3
IN VITRO TRANSKRIPTION VON YYRNA MARKER TEMPLATE SET" 52
2.7 UNTERSUCHUNG ZUR DEGRADATION VON TRANSKRIPTEN 53
2.8 ENTWICKLUNG UND HERSTELLUNG VON RIBOZYMEN 54
2.9
IN VITRO SPALTUNGSASSAYS 56
2.9.1
IN VITRO SPALTUNG VON RADIOAKTIV MARKIERTEN TRANSKRIPTEN 56
2.9.1.1 SPALTUNGSASSAYS MIT ALK-RZ1 BIS ALK-RZ5 56
2.9.1.2 SPALTUNGSASSAYS MIT MODIFIZIERTEM RIBOZYM 57
2.9.1.3 SPALTUNGSASSAYS MIT RZPUD 58
2.9.2
IN VITRO SPALTUNG VON KARPAS 299 GESAMT-RNA 59
3. ERGEBNISSE 60
3.1 IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DES NPM-ALK-PROTEINS 60
IN ZELL-LINIEN
3.1.1 IDENTIFIZIERUNG VON NPM-ALK IN ZELL-LINIEN 60
3.1.2 IMMUNPRAEZIPITATION VON NPM-ALK 61
3.1.3 BESTIMMUNG DER HALBWERTZEIT VON NPM-ALK IN KARPAS 299 ZELLEN 62
3.2
IN VIVO BINDUNG VON PROTEINEN AN NPM-ALK 63
3.2.1 ASSOZIATION VON NPM-ALK UND CD30 63
3.2.2 ASSOZIATION VON NPM-ALK UND PLC-Y 65
3.3 LOKALISATION DER BINDUNGSSTELLE VON NPM-ALK UND CD30
IN VITRO
66
3.3.1 KLONIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER GST-FUSIONSPROTEINE 66
3.3.2 KLONIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER NPM-ALK-
DELETIONSMUTANTEN 68
3.3.3 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON NPM-ALK UND DESSEN
I
NHALTSANGABE
V
DELETIONSPROTEINE 70
3.3.4 CD30 BINDET DIE ALK-DOMAENE VON NPM-ALK 71
3.3.5 LOKALISATION DER CD30-BINDUNGSSTELLE IN ALK 72
3.3.6 LOKALISATION DER ALK-BINDUNGSSTELLE IN DER CYTOPLASMATISCHEN
DOMAENE VON CD30 74
3.4 ANALYSE DER SIGNALUEBERMITTLUNG ZWISCHEN CD30 UND
NPM-ALK IN KARPAS 299 ZELLEN 76
3.4.1 UNTERSUCHUNG DER TYROSIN-PHOSPHORYLIERUNG VON KARPAS 299-
PROTEINEN 76
3.4.2 ANALYSE DER TYROSIN-PHOSPHORYLIERUNG VON NPM-ALK 78
3.4.3 ANALYSE DER PROTEININTERAKTION VON NPM-ALK UND CD30 79
3.4.4 ANALYSE DER PROTEININTERAKTION VON NPM-ALK UND PLC-Y 81
3.5 STIMULATION DER CD30-OBERFLAECHENREZEPTOREN
83
3.5.1 WACHSTUMSVERHALTEN VON KARPAS 299, JB6 UND HDLM2 WAEHREND
CD30-STIMULATION 83
3.5.2 EXPRESSION VON P21 UND P27 PROTEIN IN KARPAS 299 84
3.5.2 EXPRESSION VON P21 PROTEIN IN JB6 UND HDLM2 86
3.6 ANALYSE VON ANTI NPM-ALK-RIBOZYMEN
IN VITRO 88
3.6.1 KLONIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER SUBSTRAT-RNA 88
3.6.2 RADIOAKTIVE MARKIERUNG DER RIBOZYM-SUBSTRATE 89
3.6.3 CHARAKTERISIERUNG DER RIBOZYM-SCHNITTSTELLEN 90
3.6.4 SYNTHESE UND MARKIERUNG DER ANTI ALK-RIBOZYME 91
3.6.5 STABILITAET DER ANTI ALK-RIBOZYME
IN VITRO 92
3.6.6
IN VITRO SPALTUNGSASSY MIT ALK-RNA 93
3.6.7 VERGLEICH DER ZIELSEQUENZ VON ALK-RZ4 UND ALK-RZ5 94
3.6.8
IN VITRO SPALTUNGSASSAY MIT NPM-ALK-RNA 95
3.6.9
IN VITRO SPALTUNGSASSAY MIT MODIFIZIERTEM RIBOZYM 96
2.6.10 ANALYSE DER SPEZIFITAET VON RIBOZYM RZ1 98
3.6.11 SPALTUNGSASSAY MIT GESAMT-RNA AUS KARPAS 299 ZELLEN 99
3.6.11.1 SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DER NPM-ALK-PRIMER 99
3.6.11.2 ANALYTISCHE RT-PCR 100
INHALTSANGABE
VI
3.6.12 KLONIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON RZPUCI 102
3.6.13 SYNTHESE UND MARKIERUNG VON RZPUCI 103
3.6.14
IN VITRO SPALTUNGSASSAY MIT RZPUCI 103
3.7 ANALYSE VON ANTI NPM-ALK-RIBOZYMEN
IN VIVO 104
3.7.1 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON MODIFIZIERTEM RIBOZYM 104
3.7.2 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON RZPUCI PLASMID-DNA 106
3.7.2.1 NACHWEIS DER EXPRESSION VON NPM-ALK- UND RIBOZYM-RNA 106
3.7.2.2 ANALYSE DER
IN VIVO SPALTUNG VON NPM-ALK 107
4. DISKUSSION 109
5. ZUSAMMENFASSUNG 127
6. LITERATURVERZEICHNIS 129 |
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