Experimentelle Untersuchung zur Entwicklung einer optimierten bioresorbierbaren Polymer-Matrix für das Tissue Engineering mittels einer neuartigen Scaffold in Scaffold Technik:
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2008
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I
Inhaltsverzeichnis
1. Einführung 1
1.1 Tissue Engineering 1
1.1.1 Definition 1
1.1.2 Einsatzbereiche 1
1.1.3 Prinzipielle Verfahren des Tissue Engineering 5
1.2 Biomaterialien 10
1.2.1 Definition 10
1.2.2 Anforderungen und Ansprüche an Scaffolds 10
1.2.3 Vergleich verwendbarer Materialien - Vorteile und Nachteile 12
1.2.4 Bisher übliche Herstellungstechniken 18
1.3 Zielsetzung 25
2. Material 30
2.1 Labormaterial 30
2.2 Substanzen/Reagenzien 31
2.3 Technische Geräte 32
2.4 Software 33
3. Methoden 34
3.1 Synthese der Scaffolds 34
3.1.1 Erstellen einer Gelatinematrix 34
3.1.1.1 Fertigung einer Scaffoldmold 34
3.1.1.2 Gewinnung von Gelatinepartikeln definierter Größe 35
3.1.1.3 Fusion der Gelatinepartikel im Inkubator 36
3.1.1.4 Trocknen der Matrix im Vakuumexsikkator 37
3.1.2 Ausgießen der Matrix mit PLGA (50:50) 37
3.1.2.1 Lösen von PLGA in DCM 37
3.1.2.2 Ausgießen der Gelatinematrix mit in DCM gelöstem PLGA 39
3.1.2.3 Aushärten des PLGAs mittels Vakuumexsikkator., 40
II
3.1.3 Auswaschen der Gelatinepartikel 40
3.1.3.1 Bestimmung der optimalen Extraktionszeit 41
3.1.3.2 Untersuchung des Lösungsverhaltens in
Abhängigkeit zur „Diffusionsfläche" 41
a) Extraktion der Gelatine aus der gesamten
ausgegossenen Gelatinematrix 41
b) Extraktion der Gelatine aus der in Schnitte
geteilten ausgegossenen Gelatinematrix 41
3.1.3.3 Trocknen der fertigen Scaffolds im Vakuumexsikkator 44
3.1.3.4 Schneiden der Scaffolds, deren Gelatinematrices als
Gesamtes extrahiert wurden 44
3.2 Rasterelektronenmikroskopische Analyse 44
3.2.1 Aufbringen der Scaffolds auf Stiftprobenhalter 45
3.2.2 Besputtern der Scaffolds 45
3.2.3 Betrachtung im REM 47
3.2.3.1 Scaffolds, deren Gelatinematrices als
Gesamtes in H2O extrahiert wurden 48
3.2.3.2 Scaffolds, deren Gelatinematrices aus
Schnitten in H2O extrahiert wurden 49
3.3 Berechnung der Porosität der Scaffolds 50
3.3.1 Formelableitung 50
3.3.2 Berechnung der Porosität der Scaffolds, deren
Gelatinematrices aus Scaffoldinnenbereichs-
schnitten in H2O extrahiert wurden 51
3.4 Zellkultur 52
3.4.1 Sterilisation der Scaffolds 52
3.4.2 In vitro Analyse 52
3.4.2.1 Oberflächenbesiedelung der Scaffolds
mit Rattenstammzellen 53
3.4.2.2 Injektion der Rattenstammzellen in die Scaffolds 54
III
3.4.3 Kultivieren der mit Rattenstammzellen
besiedelten Scaffolds über sieben Tage 55
3.5 Rasterelektronenmikroskopische Analyse 56
3.5.1 Fixierung der auf den Scaffolds
kultivierten Rattenstammzellen 56
3.5.2 Gefriertrocknung 57
3.5.3 Aufbringen der Scaffolds auf Stiftprobenhalter 58
3.5.4 Besputtern der Scaffolds 58
3.5.5 Betrachtung im REM 58
4. Ergebnisse 59
4.1 Rasterelektronenmikroskopische Analyse der Scaffolds 59
4.1.1 Scaffolds, deren Gelatinematrices als
Gesamtes in H2O extrahiert wurden 59
4.1.1.1 Randbereich 60
4.1.1.2 Innenbereich 62
a) Nachweis einer kontinuierlichen homogenen Struktur 62
b) Definition der Porosität der Scaffolds
durch die Wahl der Extraktionszeit 65
c) Definierte Porengröße der Scaffolds durch den
Einsatz unterschiedlicher Gelatinepartikelgrößen 74
d) Definition der Gefügedichte der Scaffolds
durch Variation der Inkubationszeit 76
4.1.1.3 Fazit! 78
4.1.2 Scaffolds, deren Gelatinematrices aus
Schnitten in H2O extrahiert wurden 79
4.1.2.1 Randbereich 80
4.1.2.2 Innenbereich 81
a) Nachweis einer kontinuierlichen homogenen Struktur 81
b) Definition der Porosität der Scaffolds
durch die Wahl der Extraktionszeit 81
IV
c) Definierte Porengröße der Scaffolds durch den
Einsatz unterschiedlicher Gelatinepartikelgrößen 89
d) Definition der Gefügedichte der Scaffolds
durch Variation der Inkubationszeit 92
4.1.2.3 Fazit 94
4.2 Mathematische Bestimmung der Gesamtporosität der
Scaffolds, deren Gelatinematrices aus Scaffoldinnen-
bereichsschnitten in H2O extrahiert wurden 95
4.3 Rasterelektronenmikroskopische Analyse der
mit Rattenstammzellen besiedelten Scaffolds 100
4.3.1 Scaffolds, die mittels Oberflächenbesiedelung
mit Rattenstammzellen besiedelt wurden 100
4.3.2 Scaffolds, die via direkter Injektion mit
Rattenstammzellen besiedelt wurden 102
5. Diskussion 109
5.1 Vergleich der Randbereiche der Scaffolds
von Ansatz 1 und Ansatz 2 109
5.2 Vergleich der Innenbereiche der Scaffolds
von Ansatz 1 und Ansatz 2 111
5.2.1 Nachweis einer kontinuierlichen homogenen
Struktur - Effekt einer Matrix aus Gelatine 111
5.2.2 Definition der Porosität der Scaffolds durch die Wahl der
Extraktionszeit - Effekt einer optimierten Diffusionsfläche 114
5.2.3 Definierte Porengröße der Scaffolds durch den
Einsatz unterschiedlicher Gelatinepartikelgrößen -
Effekt einer optimierten Diffusionsfläche 121
5.2.4 Definition der Gefügedichte der Scaffolds durch Variation der
Inkubationszeit - Effekt einer optimierten Diffusionsfläche 124
5.3 Biokompatibilitätsprüfung durch Kultivierung mit Ratten¬
stammzellen - Vorteile der Injektionsmethode gegenüber
der konventionellen Oberflächenbesiedelungstechnik 129
V
6. Ausblick 136
6.1 Resümee 136
6.1.1 Herstellungsverfahren 136
6.1.2 Besiedelungsmethode 137
6.1.3 Zusammenfassung der erreichten Ziele : 137
6.2 Zukünftig weiterzuführende Forschungsarbeiten 139
7. Abbildungsverzeichnis 145
8. Literaturverzeichnis 147
9. Danksagung 159
10. Lebenslauf 160 |
| adam_txt |
I
Inhaltsverzeichnis
1. Einführung 1
1.1 Tissue Engineering 1
1.1.1 Definition 1
1.1.2 Einsatzbereiche 1
1.1.3 Prinzipielle Verfahren des Tissue Engineering 5
1.2 Biomaterialien 10
1.2.1 Definition 10
1.2.2 Anforderungen und Ansprüche an Scaffolds 10
1.2.3 Vergleich verwendbarer Materialien - Vorteile und Nachteile 12
1.2.4 Bisher übliche Herstellungstechniken 18
1.3 Zielsetzung 25
2. Material 30
2.1 Labormaterial 30
2.2 Substanzen/Reagenzien 31
2.3 Technische Geräte 32
2.4 Software 33
3. Methoden 34
3.1 Synthese der Scaffolds 34
3.1.1 Erstellen einer Gelatinematrix 34
3.1.1.1 Fertigung einer Scaffoldmold 34
3.1.1.2 Gewinnung von Gelatinepartikeln definierter Größe 35
3.1.1.3 Fusion der Gelatinepartikel im Inkubator 36
3.1.1.4 Trocknen der Matrix im Vakuumexsikkator 37
3.1.2 Ausgießen der Matrix mit PLGA (50:50) 37
3.1.2.1 Lösen von PLGA in DCM 37
3.1.2.2 Ausgießen der Gelatinematrix mit in DCM gelöstem PLGA 39
3.1.2.3 Aushärten des PLGAs mittels Vakuumexsikkator., 40
II
3.1.3 Auswaschen der Gelatinepartikel 40
3.1.3.1 Bestimmung der optimalen Extraktionszeit 41
3.1.3.2 Untersuchung des Lösungsverhaltens in
Abhängigkeit zur „Diffusionsfläche" 41
a) Extraktion der Gelatine aus der gesamten
ausgegossenen Gelatinematrix 41
b) Extraktion der Gelatine aus der in Schnitte
geteilten ausgegossenen Gelatinematrix 41
3.1.3.3 Trocknen der fertigen Scaffolds im Vakuumexsikkator 44
3.1.3.4 Schneiden der Scaffolds, deren Gelatinematrices als
Gesamtes extrahiert wurden 44
3.2 Rasterelektronenmikroskopische Analyse 44
3.2.1 Aufbringen der Scaffolds auf Stiftprobenhalter 45
3.2.2 Besputtern der Scaffolds 45
3.2.3 Betrachtung im REM 47
3.2.3.1 Scaffolds, deren Gelatinematrices als
Gesamtes in H2O extrahiert wurden 48
3.2.3.2 Scaffolds, deren Gelatinematrices aus
Schnitten in H2O extrahiert wurden 49
3.3 Berechnung der Porosität der Scaffolds 50
3.3.1 Formelableitung 50
3.3.2 Berechnung der Porosität der Scaffolds, deren
Gelatinematrices aus Scaffoldinnenbereichs-
schnitten in H2O extrahiert wurden 51
3.4 Zellkultur 52
3.4.1 Sterilisation der Scaffolds 52
3.4.2 In vitro Analyse 52
3.4.2.1 Oberflächenbesiedelung der Scaffolds
mit Rattenstammzellen 53
3.4.2.2 Injektion der Rattenstammzellen in die Scaffolds 54
III
3.4.3 Kultivieren der mit Rattenstammzellen
besiedelten Scaffolds über sieben Tage 55
3.5 Rasterelektronenmikroskopische Analyse 56
3.5.1 Fixierung der auf den Scaffolds
kultivierten Rattenstammzellen 56
3.5.2 Gefriertrocknung 57
3.5.3 Aufbringen der Scaffolds auf Stiftprobenhalter 58
3.5.4 Besputtern der Scaffolds 58
3.5.5 Betrachtung im REM 58
4. Ergebnisse 59
4.1 Rasterelektronenmikroskopische Analyse der Scaffolds 59
4.1.1 Scaffolds, deren Gelatinematrices als
Gesamtes in H2O extrahiert wurden 59
4.1.1.1 Randbereich 60
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durch die Wahl der Extraktionszeit 65
c) Definierte Porengröße der Scaffolds durch den
Einsatz unterschiedlicher Gelatinepartikelgrößen 74
d) Definition der Gefügedichte der Scaffolds
durch Variation der Inkubationszeit 76
4.1.1.3 Fazit! 78
4.1.2 Scaffolds, deren Gelatinematrices aus
Schnitten in H2O extrahiert wurden 79
4.1.2.1 Randbereich 80
4.1.2.2 Innenbereich 81
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b) Definition der Porosität der Scaffolds
durch die Wahl der Extraktionszeit 81
IV
c) Definierte Porengröße der Scaffolds durch den
Einsatz unterschiedlicher Gelatinepartikelgrößen 89
d) Definition der Gefügedichte der Scaffolds
durch Variation der Inkubationszeit 92
4.1.2.3 Fazit 94
4.2 Mathematische Bestimmung der Gesamtporosität der
Scaffolds, deren Gelatinematrices aus Scaffoldinnen-
bereichsschnitten in H2O extrahiert wurden 95
4.3 Rasterelektronenmikroskopische Analyse der
mit Rattenstammzellen besiedelten Scaffolds 100
4.3.1 Scaffolds, die mittels Oberflächenbesiedelung
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4.3.2 Scaffolds, die via direkter Injektion mit
Rattenstammzellen besiedelt wurden 102
5. Diskussion 109
5.1 Vergleich der Randbereiche der Scaffolds
von Ansatz 1 und Ansatz 2 109
5.2 Vergleich der Innenbereiche der Scaffolds
von Ansatz 1 und Ansatz 2 111
5.2.1 Nachweis einer kontinuierlichen homogenen
Struktur - Effekt einer Matrix aus Gelatine 111
5.2.2 Definition der Porosität der Scaffolds durch die Wahl der
Extraktionszeit - Effekt einer optimierten Diffusionsfläche 114
5.2.3 Definierte Porengröße der Scaffolds durch den
Einsatz unterschiedlicher Gelatinepartikelgrößen -
Effekt einer optimierten Diffusionsfläche 121
5.2.4 Definition der Gefügedichte der Scaffolds durch Variation der
Inkubationszeit - Effekt einer optimierten Diffusionsfläche 124
5.3 Biokompatibilitätsprüfung durch Kultivierung mit Ratten¬
stammzellen - Vorteile der Injektionsmethode gegenüber
der konventionellen Oberflächenbesiedelungstechnik 129
V
6. Ausblick 136
6.1 Resümee 136
6.1.1 Herstellungsverfahren 136
6.1.2 Besiedelungsmethode 137
6.1.3 Zusammenfassung der erreichten Ziele : 137
6.2 Zukünftig weiterzuführende Forschungsarbeiten 139
7. Abbildungsverzeichnis 145
8. Literaturverzeichnis 147
9. Danksagung 159
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| spellingShingle | Graßl, Martina Gabriele 1982- Experimentelle Untersuchung zur Entwicklung einer optimierten bioresorbierbaren Polymer-Matrix für das Tissue Engineering mittels einer neuartigen Scaffold in Scaffold Technik Scaffold Biologie (DE-588)4998369-6 gnd Tissue Engineering (DE-588)4646061-5 gnd |
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