Verfügbarkeit: Untersuchungen zur Rolle der Integrated Stress Response, der Heat Shock Response und NRF2-vermittelter Mechanismen bei der Stressresistenz embryonaler Kardiomyoblasten gegenüber mitochondrialer Komplex-III-Inhibierung

Untersuchungen zur Rolle der Integrated Stress Response, der Heat Shock Response und NRF2-vermittelter Mechanismen bei der Stressresistenz embryonaler Kardiomyoblasten gegenüber mitochondrialer Komplex-III-Inhibierung:

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser:	Grün, Bent Frithjof 1991- (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Buch
Sprache:	German
Veröffentlicht:	Münster [2021]
Schlagworte:	Mitochondrium Zellkultur Herzmuskelzelle Pathogenese Kälteschock-Proteine Hochschulschrift
Online-Zugang:	Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis
Beschreibung:	158 Blätter Illustrationen, Diagramme 30 cm

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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG .............................................................................................................. 1 1.1 DIE ROLLE VON MITOCHONDRIEN BEI DER PATHOGENESE KARDIALER ERKRANKUNGEN .. 1 1.2 AUFBAU UND PHYSIOLOGISCHE FUNKTIONEN VON MITOCHONDRIEN ........................... 2 1.3 MITOCHONDRIALE DYSFUNKTION UNTER PATHOLOGISCHEN BEDINGUNGEN .................... 6 1.3.1 ZELLULAERE SCHUTZMECHANISMEN BEI MITOCHONDRIALER DYSFUNKTION UND OXIDATIVEM STRESS ............................................................................ 10 1.3.2 DIE MITOCHONDRIALE UNFOLDED PROTEIN RESPONSE (UPR MT ) ....................... 10 1.3.3 DIE INTEGRATED STRESS RESPONSE (ISR) .................................................. 13 1.3.4 DIE HEAT SHOCK RESPONSE ..................................................................... 16 1.3.5 ANTIOXIDATIVE MECHANISMEN .................................................................. 17 1.4 STRESSRESISTENZ EMBRYONALER KARDIOMYOZYTEN BEI MITOCHONDRIALER DYSFUNKTION ................................................................................................... 20 1.5 ZIELSETZUNG UND HYPOTHESE .......................................................................... 23 2 MATERIAL ................................................................................................................ 25 2.1 CHEMIKALIEN UND SUBSTANZEN ....................................................................... 25 2.2 GERAETE ........................................................................................................... 26 2.3 VERBRAUCHSMATERIALIEN .................................................................................. 26 2.4 PUFFER UND LOESUNGEN ................................................................................... 27 2.5 SUBSTANZEN FUER DIE ZELLKULTUR ........................................................................ 28 2.6 INHIBITOREN ..................................................................................................... 29 2.7 GROESSENSTANDARDS .......................................................................................... 29 2.8 ENZYME UND KITS ........................................................................................... 29 2.9 ANTIKOERPER ..................................................................................................... 30 2.10 SIRNA UND TRANSFEKTIONSMATERIALIEN ............................................................ 31 2.11 PRIMER FUER DIE QUANTITATIVE REAL-TIME-PCR ................................................... 32 2.12 FLUORESZENZFARBSTOFFE ZUR DETEKTION VON ROS ............................................. 33 2.13 SOFTWARE ........................................................................................................ 33 2.14 ONLINE-SOFTWARE UND DATENBANKEN ............................................................... 33 3 METHODEN ............................................................................................................. 34 3.1 ZELLKULTUR ....................................................................................................... 34 3.1.1 ZELLKULTIVIERUNG ...................................................................................... 34 3.1.2 PROTEINEXTRAKTION .................................................................................... 34 3.1.3 RNA-EXTRAKTION ..................................................................................... 35 3.1.4 MTT-ASSAY ............................................................................................. 35 3.2 WESTERN BLOT ANALYSE ................................................................................... 36 3.2.1 BESTIMMUNG VON PROTEINKONZENTRATIONEN ............................................. 36 3.2.2 SDS-POLYACRYLAMID-GELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) ............................. 36 3.2.3 WESTERN BLOT 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............................................ 44 3.3.8 XBP1 -SPLICING ANALYSE ......................................................................... 45 3.4 RNA-INTERFERENZ ............................................................................................ 46 3.4.1 PRINZIP DER RNA-INTERFERENZ .................................................................. 46 3.4.2 UNSPEZIFISCHE EFFEKTE DER SIRNA-TRANSFEKTION ..................................... 47 3.4.3 AUFBAU DER TRANSFEKTION ........................................................................ 48 3.4.4 ABLAUF DER TRANSFEKTION ......................................................................... 48 3.5 NACHWEIS VON REAKTIVEN SAUERSTOFFVERBINDUNGEN ......................................... 49 3.5.1 MESSUNG REAKTIVER SAUERSTOFFVERBINDUNGEN ......................................... 49 3.5.2 VERWENDUNG VON MITOSOXYY RED ......................................................... 50 3.5.3 VERWENDUNG VON CELLROX GREEN ...................................................... 50 3.6 STATISTISCHE AUSWERTUNG ............................................................................... 51 4 ERGEBNISSE ......................................................................................................... 52 4.1 INHIBITION DER MITOCHONDRIALEN ATMUNGSKETTE IN H9C2-ZELLEN ........................... 52 4.1.1 ZELLLINIE UND IN-VITRO-EXPERIMENTE .......................................................... 52 4.1.2 H9C2-ZELLEN UEBERLEBEN KOMPLEX-ILL-INHIBITION DURCH ANTIMYCIN A ........ 53 4.1.3 ATMUNGSKETTEN-KOMPLEX-I-INHIBITION DURCH ROTENON REDUZIERT DAS WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN .................................................................. 54 4.1.4 VERGLEICHBARE PRODUKTION VON REAKTIVEN SAUERSTOFFVERBINDUNGEN IN H9C2-ZELLEN UNTER ANTIMYCIN A UND ROTENON ....................................... 56 4.1.5 H9C2-ZELLEN AKTIVIEREN UNTER ANTIMYCIN A AEHNLICHE MECHANISMEN WIE HCCS-DEFIZIENTE KARDIOMYOZYTEN ....................................................... 59 4.2 PHARMAKOLOGISCHE INHIBITION DER INTEGRATED STRESS RESPONSE IN ANTIMYCIN A-BEHANDELTEN H9C2-ZELLEN ......................................................... 63 4.3 OPTIMIERUNG DER TRANSFEKTIONSBEDINGUNGEN IN H9C2-ZELLEN ........................ 67 4.4 KNOCKDOWN VON ATF4 FUEHRT ZUR GENERELLEN INHIBITION DES WACHSTUMS VON H9C2-ZELLEN .................................................................................................. 69 4.5 STUMMSCHALTUNG VON CHOP HAT KEINEN NEGATIVEN EINFLUSS AUF DAS WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN UNTER ANTIMYCIN A ............................................ 76 4.6 HSP60-STUMMSCHALTUNG FUEHRT ZU EINER MODERATEN REDUKTION DES WACHSTUMS VON H9C2-ZELLEN UNTER ANTIMYCIN A ........................................... 83 4.7 STUMMSCHALTUNG VON HSF1 HAT KEINEN NEGATIVEN EINFLUSS AUF DAS WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN UNTER ANTIMYCIN A ............................................ 87 4.8 STUMMSCHALTUNG VON NRF2 REDUZIERT WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN UNTER ANTIMYCIN A ................................................................................................... 92 5 DISKUSSION......................................................................................................... 100 5.1 UNTERSCHIEDLICHE EFFEKTE EINER MITOCHONDRIALEN KOMPLEX-I UND KOMPLEX LLL-LNHIBITION AUF H9C2-ZELLEN ....................................................................... 100 5.1.1 METHODISCHE ASPEKTE DES MITTELS MTT-TEST GEMESSENEN ZELLWACHSTUMS ................................................................................... 102 5.2 VERGLEICH DER KOMPLEX-ILL-INHIBITION DURCH ANTIMYCIN A IN-VITRO MIT DEM HCCS-KNOCKOUT IN-VIVO ................................................................................ 103 5.3 STELLENWERT DER INTEGRATED STRESS RESPONSE HINSICHTLICH DER STRESS RESISTENZ VON H9C2-ZELLEN ............................................................... 107 5.3.1 PHARMAKOLOGISCHE INHIBITION DER ISR HAT KEINEN EINFLUSS AUF DAS WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN UNTER ANTIMYCIN A-BEHANDLUNG ............ 107 5.3.2 ATF4-STUMMSCHALTUNG FUEHRT ZUR GENERELLEN WACHSTUMSREDUKTION 109 5.3.3 STUMMSCHALTUNG VON CHOP HAT KEINEN NEGATIVEN EINFLUSS AUF DAS WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN UNTER ANTIMYCIN A ................................... 113 5.4 STELLENWERT VON HITZESCHOCKPROTEINEN FUER DAS WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN UNTER MITOCHONDRIALER DYSFUNKTION .............................................................. 119 5.4.1 HSP60-KNOCKDOWN BEEINFLUSST TEILWEISE DAS WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN ......................................................................................... 119 5.4.2 HSF1-STUMMSCHALTUNG REDUZIERT NICHT DAS WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN UNTER ANTIMYCIN A .......................................................... 123 5.5 NRF2 IST VON RELEVANZ FUER DAS WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN UNTER KOMPLEX-ILL-INHIBIERUNG .............................................................................. 127 5.6 FAZIT UND AUSBLICK ....................................................................................... 132 6 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS ................................................................................... 136 7 ABBILDUNGSVERZEICHNIS .................................................................................... 139 8 TABELLENVERZEICHNIS .......................................................................................... 140 9 LITERATURVERZEICHNIS.......................................................................................... 141 10 DANKSAGUNG ...................................................................................................... 157 11 LEBENSLAUF ......................................................................................................... 158
adam_txt	INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG . 1 1.1 DIE ROLLE VON MITOCHONDRIEN BEI DER PATHOGENESE KARDIALER ERKRANKUNGEN . 1 1.2 AUFBAU UND PHYSIOLOGISCHE FUNKTIONEN VON MITOCHONDRIEN . 2 1.3 MITOCHONDRIALE DYSFUNKTION UNTER PATHOLOGISCHEN BEDINGUNGEN . 6 1.3.1 ZELLULAERE SCHUTZMECHANISMEN BEI MITOCHONDRIALER DYSFUNKTION UND OXIDATIVEM STRESS . 10 1.3.2 DIE MITOCHONDRIALE UNFOLDED PROTEIN RESPONSE (UPR MT ) . 10 1.3.3 DIE INTEGRATED STRESS RESPONSE (ISR) . 13 1.3.4 DIE HEAT SHOCK RESPONSE . 16 1.3.5 ANTIOXIDATIVE MECHANISMEN . 17 1.4 STRESSRESISTENZ EMBRYONALER KARDIOMYOZYTEN BEI MITOCHONDRIALER DYSFUNKTION . 20 1.5 ZIELSETZUNG UND HYPOTHESE . 23 2 MATERIAL . 25 2.1 CHEMIKALIEN UND SUBSTANZEN . 25 2.2 GERAETE . 26 2.3 VERBRAUCHSMATERIALIEN . 26 2.4 PUFFER UND LOESUNGEN . 27 2.5 SUBSTANZEN FUER DIE ZELLKULTUR . 28 2.6 INHIBITOREN . 29 2.7 GROESSENSTANDARDS . 29 2.8 ENZYME UND KITS . 29 2.9 ANTIKOERPER . 30 2.10 SIRNA UND TRANSFEKTIONSMATERIALIEN . 31 2.11 PRIMER FUER DIE QUANTITATIVE REAL-TIME-PCR . 32 2.12 FLUORESZENZFARBSTOFFE ZUR DETEKTION VON ROS . 33 2.13 SOFTWARE . 33 2.14 ONLINE-SOFTWARE UND DATENBANKEN . 33 3 METHODEN . 34 3.1 ZELLKULTUR . 34 3.1.1 ZELLKULTIVIERUNG . 34 3.1.2 PROTEINEXTRAKTION . 34 3.1.3 RNA-EXTRAKTION . 35 3.1.4 MTT-ASSAY . 35 3.2 WESTERN BLOT ANALYSE . 36 3.2.1 BESTIMMUNG VON PROTEINKONZENTRATIONEN . 36 3.2.2 SDS-POLYACRYLAMID-GELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) . 36 3.2.3 WESTERN BLOT . 37 3.2.4 IMMUNDETEKTION . 38 3.3 POLYMERASE-KETTENREAKTION . 39 3.3.1 RNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG. 39 3.3.2 CDNA-SYNTHESE . 39 3.3.3 PRINZIP DER PCR . 40 3.3.4 PRIMER-DESIGN . 41 3.3.5 OPTIMIERUNG DER ANNEALING-TEMPERATUR . 41 3.3.6 OPTIMIERUNG DER PRIMERKONZENTRATION . 42 3.3.7 GENEXPRESSIONSANALYSE MITTELS QRT-PCR . 44 3.3.8 XBP1 -SPLICING ANALYSE . 45 3.4 RNA-INTERFERENZ . 46 3.4.1 PRINZIP DER RNA-INTERFERENZ . 46 3.4.2 UNSPEZIFISCHE EFFEKTE DER SIRNA-TRANSFEKTION . 47 3.4.3 AUFBAU DER TRANSFEKTION . 48 3.4.4 ABLAUF DER TRANSFEKTION . 48 3.5 NACHWEIS VON REAKTIVEN SAUERSTOFFVERBINDUNGEN . 49 3.5.1 MESSUNG REAKTIVER SAUERSTOFFVERBINDUNGEN . 49 3.5.2 VERWENDUNG VON MITOSOXYY RED . 50 3.5.3 VERWENDUNG VON CELLROX GREEN . 50 3.6 STATISTISCHE AUSWERTUNG . 51 4 ERGEBNISSE . 52 4.1 INHIBITION DER MITOCHONDRIALEN ATMUNGSKETTE IN H9C2-ZELLEN . 52 4.1.1 ZELLLINIE UND IN-VITRO-EXPERIMENTE . 52 4.1.2 H9C2-ZELLEN UEBERLEBEN KOMPLEX-ILL-INHIBITION DURCH ANTIMYCIN A . 53 4.1.3 ATMUNGSKETTEN-KOMPLEX-I-INHIBITION DURCH ROTENON REDUZIERT DAS WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN . 54 4.1.4 VERGLEICHBARE PRODUKTION VON REAKTIVEN SAUERSTOFFVERBINDUNGEN IN H9C2-ZELLEN UNTER ANTIMYCIN A UND ROTENON . 56 4.1.5 H9C2-ZELLEN AKTIVIEREN UNTER ANTIMYCIN A AEHNLICHE MECHANISMEN WIE HCCS-DEFIZIENTE KARDIOMYOZYTEN . 59 4.2 PHARMAKOLOGISCHE INHIBITION DER INTEGRATED STRESS RESPONSE IN ANTIMYCIN A-BEHANDELTEN H9C2-ZELLEN . 63 4.3 OPTIMIERUNG DER TRANSFEKTIONSBEDINGUNGEN IN H9C2-ZELLEN . 67 4.4 KNOCKDOWN VON ATF4 FUEHRT ZUR GENERELLEN INHIBITION DES WACHSTUMS VON H9C2-ZELLEN . 69 4.5 STUMMSCHALTUNG VON CHOP HAT KEINEN NEGATIVEN EINFLUSS AUF DAS WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN UNTER ANTIMYCIN A . 76 4.6 HSP60-STUMMSCHALTUNG FUEHRT ZU EINER MODERATEN REDUKTION DES WACHSTUMS VON H9C2-ZELLEN UNTER ANTIMYCIN A . 83 4.7 STUMMSCHALTUNG VON HSF1 HAT KEINEN NEGATIVEN EINFLUSS AUF DAS WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN UNTER ANTIMYCIN A . 87 4.8 STUMMSCHALTUNG VON NRF2 REDUZIERT WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN UNTER ANTIMYCIN A . 92 5 DISKUSSION. 100 5.1 UNTERSCHIEDLICHE EFFEKTE EINER MITOCHONDRIALEN KOMPLEX-I UND KOMPLEX LLL-LNHIBITION AUF H9C2-ZELLEN . 100 5.1.1 METHODISCHE ASPEKTE DES MITTELS MTT-TEST GEMESSENEN ZELLWACHSTUMS . 102 5.2 VERGLEICH DER KOMPLEX-ILL-INHIBITION DURCH ANTIMYCIN A IN-VITRO MIT DEM HCCS-KNOCKOUT IN-VIVO . 103 5.3 STELLENWERT DER INTEGRATED STRESS RESPONSE HINSICHTLICH DER STRESS RESISTENZ VON H9C2-ZELLEN . 107 5.3.1 PHARMAKOLOGISCHE INHIBITION DER ISR HAT KEINEN EINFLUSS AUF DAS WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN UNTER ANTIMYCIN A-BEHANDLUNG . 107 5.3.2 ATF4-STUMMSCHALTUNG FUEHRT ZUR GENERELLEN WACHSTUMSREDUKTION 109 5.3.3 STUMMSCHALTUNG VON CHOP HAT KEINEN NEGATIVEN EINFLUSS AUF DAS WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN UNTER ANTIMYCIN A . 113 5.4 STELLENWERT VON HITZESCHOCKPROTEINEN FUER DAS WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN UNTER MITOCHONDRIALER DYSFUNKTION . 119 5.4.1 HSP60-KNOCKDOWN BEEINFLUSST TEILWEISE DAS WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN . 119 5.4.2 HSF1-STUMMSCHALTUNG REDUZIERT NICHT DAS WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN UNTER ANTIMYCIN A . 123 5.5 NRF2 IST VON RELEVANZ FUER DAS WACHSTUM VON H9C2-ZELLEN UNTER KOMPLEX-ILL-INHIBIERUNG . 127 5.6 FAZIT UND AUSBLICK . 132 6 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS . 136 7 ABBILDUNGSVERZEICHNIS . 139 8 TABELLENVERZEICHNIS . 140 9 LITERATURVERZEICHNIS. 141 10 DANKSAGUNG . 157 11 LEBENSLAUF . 158
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