Charakterisierung des Chitinasegens und Untersuchungen zur hormonellen Regulation der Chitinase von Chironomus tentans:
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Format: | Buch |
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Veröffentlicht: |
2002
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Beschreibung: | Ulm, Univ., Diss., 2002 |
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INHALTSVERZEICHNIS
A. EINLEITUNG 1
B. MATERIAL 6
B.1 BIOLOGISCHES MATERIAL 6
B.2
PRIMER UND VEKTOREN 6
B.3 KITS UND CHEMIKALIEN 7
B.4 GERAETE 9
B. 5 COMPUTERSOFTWARE 9
C. METHODEN 10
C.1
CHIRONOMUS TENTANS-ZELL-LINIE 10
C.2 ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA AUS
CHIRONOMUS TENTANS ZELLEN 10
C.2.1 QUANTIFIZIERUNG VON DNA 11
C.2.2 RESTRIKTIONSVERDAU DER GENOMISCHEN DNA 11
C.2.3 SOUTHERN BLOT 11
C.2.3.1 HERSTELLUNG UND MARKIERUNG DER SONDEN FUER DEN-SOUTHERN BLOT 12
C.2.3.2 HYBRIDISIERUNG DER MEMBRANEN 13
C.2.3.3 WASCHEN DER MEMBRANEN 13
C.3
SCREENING DER GENOMISCHEN BANK, HERGESTELLT AUS DER ZELL-LINIE VON
CHIRONOMUS
TENTANS 14
C.3.1 HERSTELLUNG UND MARKIERUNG EINER SONDE FUER DAS
SCREENING 14
C.3.2 VORBEREITUNG DER BAKTERIEN FUER DAS SCREENING 14
C.3.2.1 ANLEGEN VON GLYCERINKULTUREN 15
C.3.2.2 VORBEREITUNG DER BAKTERIEN ZUM AUSPLATTIEREN 15
C.3.3 BESTIMMUNG DES PHAGENTITERS 15
C.3.4
PLAQUELIFTS 16
C.3.4.1 1.
SCREENING 16
C.3.4.2 2.
SCREENING 16
C.3.5 HERSTELLUNG VON PHAGENLYSATEN 16
C.3.6 ISOLIERUNG DER
X DNA 17
C.4 AMPLIFIKATION DURCH PCR 17
C.5 NACHWEIS UND TRENNUNG VON DNA DURCH GELELEKTROPHORESE 18
C.5.1 AGAROSEGELE 18
C.5.2 POLYACRYLAMIDGELE 19
C.5.3 AUFREINIGUNG VON DNA 19
C.6 KLONIERUNG IN
E. COLI 19
C.6.1 HERSTELLUNG VON KOMPETENTEN
COLI XL1-BLUE MRA 20
C.6.2 LIGATION
YY
21
C.6.3 TRANSFORMATION 21
C.6.4 ISOLIERUNG VON PLASMID DNA 22
C.7 SEQUENZIERUNG 22
C.7.1 GELELEKTROPHORESE 23
C.8 EINFLUSS VON 20-OH-ECDYSON UND METHOPREN AUF DIE CHITINASEAKTIVITAET
IN DER
ZELL-LINIE VON CHIRONOMUS TENTANS 24
C.8.1 ANSETZEN DER ZELLEN FUER DIE ZEITABHAENGIGKEIT DER HORMONWIRKUNG 24
C.8.2 BEHANDLUNG DER ZELLEN MIT ACTINOMYCIN D 24
C.8.3 RNA ISOLIERUNG 24
C.8.3.1 BESTIMMUNG VON KONZENTRATION UND REINHEIT DER RNA 25
C.8.4 BESTIMMUNG DER TRANSKRIPTMENGE AN CHITINASE-RNA MIT EINER
CHITINASE-
SPEZIFISCHEN SONDE 25
C.8.4.1 BEHANDLUNG VON GERAETEN UND LOESUNGEN ZUR VERMEIDUNG VON RNASE-
KONTAMINATIONEN 25
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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C.8.4.2 GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG DER RNA NACH DENATURIERUNG
MIT GLYOXAL UND DMSO 26
C.8.4.3 NORTHERN BLOT 26
C.8.4.4 HYBRIDISIERUNG DER MEMBRAN UND MARKIERUNG DER SONDE 27
C.8.5 RACE PAT (RAPID AMPLIFICATION OFCDNA ENDS POLY (A) TEST) 28
C. 8.6 BESTIMMUNG DER SYNTHESERATE AN CHITINASE-MRNA 30
C.8.6.1 ZELLKEMISOLIERUNG 30
C.8.6.2 SLOT BLOT UND FILTER-HYBRIDISIERUNG 31
C.9 CHITINASETEST 32
C. 10 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD , 33
YY
.ERGEBNISSE 34
D. 1 SOUTHERN BLOT 34
D.2 GENOMISCHE STRUKTUR DES CHITINASEGENS AUS DER ZELL-LINIE VON
CHIRONOMUS
TENTANS 37
D. 2.1 ORGANISATION DES GENS 37
D.2.2 DIE SEQUENZ DES CHITINASEGENS AUS
CHIRONOMUS TENTANS 38
D 2.3 DER 5'-UNTRANSLATIERTER BEREICH _ 41
D.2.4 DER 3'-UNTRANSLATIERTER BEREICH ~ 42
D.2.5 INTRON 2 43
D.2.6 VERGLEICHE DER CHITINASESEQUENZ MIT DEM GENOM VON
DROSOPHILA
MELANOGASTER UND MIT ANDEREN BEKANNTEN CHITINASEN 44
D. 3 EINFLUSS VON 20-OH-ECDYSON UND METHOPREN AUF DIE CHITINASEAKTIVITAET
47
D.3.1 CHITINASETEST 47
D.3.2 NORTHERN BLOT 48
D.3.3 BESTIMMUNG DER POLY (A)-SCHWANZ-LAENGE MIT RACE PAT 49
D.3.4 BESTIMMUNG DER HALBWERTSZEIT DER CHITINASE-MRNA 51
D.3.5 BESTIMMUNG DER SYNTHESERATE AN CHITINASE-MRNA 52
E. DISKUSSION 54
E.1 SOUTHERN BLOT 54
E.2 DIE GENOMISCHE STRUKTUR DES CHITINASEGENS 56
E. 3 EINFLUSS VON 20-OH-ECDYSON UND METHOPREN AUF DIE CHITINASEAKTIVITAET
58
F. ZUSAMMENFASSUNG 62
G. LITERATURVERZEICHNIS 64
H. ANHANG 72 |
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