Verfügbarkeit: Der Einfluss intrazellulär gelegener, gruppierter Cystein-Reste auf die Expression und Membranporen-Bildung des humanen P2X7-Rezeptors

Der Einfluss intrazellulär gelegener, gruppierter Cystein-Reste auf die Expression und Membranporen-Bildung des humanen P2X7-Rezeptors:

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser:	Fritsch, Sebastian Johannes 1983- (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Buch
Sprache:	German
Veröffentlicht:	Aachen [2016]
Schlagworte:	Hochschulschrift
Online-Zugang:	Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis
Beschreibung:	IX, 93 Seiten Illustrationen 21 cm

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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS ________________________________________________ III ABKUERZUNGSVERZEICHNIS ____________________________________________ VII 1 EINLEITUNG_________________________________________________________1 1.1 DER P2X7-REZEPTOR ________________________________________ 1 1.1.1 STRUKTUR ____________________________________________ 1 1.1.2 ELEKTROPHYSIOLOGIE____________________________________2 1.1.3 PORENBILDUNG _______________________________________ 3 1.1.4 EXPRESSION__________________________________________ 6 1.1.5 DOWNSTREAM-EFFEKTE NACH AKTIVIERUNG UND PHYSIOLOGISCHE EFFEKTE DES REZEPTORS_____________________________7 1.1.6 PATHOPHYSIOLOGIE _____________________________________ 10 1.1.7 DIE INTRAZELLULAERE C-TERMINALE DOMAENE DES P2X7-REZEPTORS ___ 11 1.2.CYSTEINRESTE IM P2X7-REZEPTOR ________________________________ 13 2 ZIELSETZUNG________________________________________________________ 17 3 MATERIAL UND METHODEN ____________________________________________ 18 3.1 MATERIALIEN________________________________________________ 18 3.1.1 CHEMIKALIEN _______________________________________ 18 3.1.2 OLIGONUKLEOTIDE ______________________________________ 18 3.1.3 RESTRIKTIONSENZYME ___________________________________ 18 3.1.4 ZELLKULTUR ___________________________________________ 18 3.1.5 ANTIKOERPER___________________________________________ 18 3.1.6 GENE UND VEKTOREN __________________________________ 18 3.1 METHODEN _________________________________________________ 19 3.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN _________________________ 19 3.2.1.1 GERICHTETE MUTAGENESE____________________________19 3.2.1.2 CRNA-PRODUKTION _______________________________ 20 3.2.2 HETEROLOGE PROTEINEXPRESSION IN XENOPUS LAEVIS-OOZYTEN_____20 3.2.2.1 HERKUNFT UND HALTUNG DER FROESCHE __________________ 20 3.2.2.2 ENTNAHME DES OVARS _____________________________ 20 3.2.2.3 VORBEREITUNG DER OOZYTEN _________________________ 21 3.2.2.4 INJEKTION DER RNA _______________________________ 22 3.2.2.5 BEHANDLUNG DER OOZYTEN MIT REDUKTIONMITTELN _________ 22 3.2.3 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN__________________________22 3.2.3.1 METABOLISCHE MARKIERUNG MIT L-[35S]-METHIONIN _______ 22 3.2.3.2 OBERFLAECHENMARKIERUNG MITTELS CY5-MONO-NHS-ESTER __ 23 3.2.3.3 PROTEIN-AUFREINIGUNG MITTELS AFFMITAETS-CHROMATOGRAPHIE_23 3.2.3.4 N-DEGLYKOSYLIERUNG______________________________25 3.2.3.5 AUFTRENNUNG DER PROTEINE MITTELS SDS-PAGE __________ 26 3.2.3.5.1 VORBEREITUNG DER PROBEN ____________________ 26 3.2.3.5.2 HERSTELLUNG DER POLYACRYLAMID-GELE ___________ 26 3.2.3.5.3 DURCHFUEHRUNG DER SDS-PAGE _______________ 27 3.2.3.6 DETEKTION DER PROTEINE ____________________________ 28 3.2.3.6.1 TYPHOON-FLUORESZENZ IMAGING _______________ 28 3.2.3.6.2 PHOSPHOR IMAGING _________________________ 28 3.2.3.6.3 AUSWERTUNG DER IMAGING-DATEN ______________ 28 3.2.4 ZELLKULTUR ___________________________________________ 29 3.2.4.1 EINLEITUNG______________________________________29 3.2A2 DAS FLP-INT-REX-293-SYSTEM __________________ 29 3.2.4.3 KULTUR DER ZELLEN ________________________________ 30 3.2.4.4 STABILE TRANSAKTION______________________________ 31 3.2.4.5 INDUKTION DER GENEXPRESSION _______________________ 31 3.2.5 WESTERN BLOTTING _____________________________________ 33 3.2.5.1 ERSTELLUNG VON ZELL-LYSATEN UND VORBEREITUNG DES BLOTTINGS _________________________________ 33 3.2.5.2 DURCHFUEHRUNG DES BLOTTINGS ________________________ 33 3.2.5.3 ENTWICKLUNG DES BLOTS ____________________________ 33 3.2.6 DURCHFLUSSZYTOMETRIE__________________________________ 34 3.2.6.1 DURCHFLUSSZYTOMETER UND SOFTWARE __________________ 34 3.2.6.2 ANALYSE DER OBERFLAECHENEXPRESSION DES P2X7-REZEPTORS 35 3.2.6.3 ANALYSE DER P2X7R-VERMITTELTEN PORENBILDUNG________ 35 3.2.7 STATISTISCHE AUSWERTUNG________________________________ 36 4 ERGEBNISSE ______________________________________________________ 37 4.1 ERSTELLUNG VON CYSTEIN-ZU-ALANIN-MUTANTEN DES HP2X7-REZEPTORS ____ 37 4.2 PROTEINCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER CYSTEIN-ZU-ALANIN-MUTANTEN DES HP2X7-REZEPTORS IN XENOPUS FAEV/S-OOZYTEN _____________ 38 4.3 DER EINFLUSS VON REDUKTIONMITTELN AUF DIE EXPRESSION DES WT-HP2X7- REZEPTORS UND DER MUTANTE C477,479,482A-HP2X7 IN XENOPUS LAEVIS-OOZYTTN ________________________________ 40 4.4 N-DEGLYKOSYLIERUNG DES WT-HP2X7R, DER MUTANTE C493,498,499,506A- P2X7R UND DES TRUNKIERTEN HP2X7RM36 ____________________42 4.5 PROTEINCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER CYSTEIN-ZU-ALANIN-MUTANTEN DES HP2X7-REZEPTORS IN F LP-INT-REX-293-ZEL LEN ________ 44 4.6 UNTERSUCHUNGEN ZUR PORENBILDUNGSFAHIGKEIT DER CYSTEIN-ZU-ALANIN- MUTANTEN DES HP2X7-REZEPTORS IN FLP-INT-REX-293-ZELLEN_48 5 DISKUSSION_________________________________________________________53 5.1 DIE PRODUKTION DER CYSTEIN-ZU-ALANIN-MUTANTEN _________________ 53 5.2 DIE EXPRESSION DER CYSTEIN-ZU-ALANIN-MUTANTEN __________________ 53 5.2.1 EXPRIMIERTE MUTANTEN UND SPALTPRODUKTE __________________ 53 5.2.2 DIE EXPRESSIONSSYSTEME _______________________________ 54 5.2.3 DIE MUTANTE C572573A-HP2X7 ___________________________ 55 5.2.4 PALMITOYLIERUNG DES P2X7-REZEPTORS _____________________ 56 5.2.5 INTERAKTION MIT DER ZELLMEMBRAN _____________________ 57 5.3 DER EINFLUSS VON REDUKTIONSMITTELN AUF DIE EXPRESSION DES WT-P2X7R UND DER MUTANTE C477479482A-HP2X7_______________________59 5.4 DIE N-DEGLYKOSYLIERUNG DES WT-HP2X7R, DER MUTANTE C 493498499,506A- P2X7R UND EINES TRUNKIERTEN HP2X7R1-436 __________________ 60 5.5 DIE PORENBILDUNG DER CYSTEIN-ZU-ALANIN-MUTANTEN ________________ 62 5.5.1 DER VERSUCHSANSATZ ___________________________________ 62 5.5.2 DIE CYSTEINRESTE ZWISCHEN DEN POSITIONEN 363 UND 377 _______ 64 5.5.3 DER P2X7A360 377-REZEPTOR________________________________64 5.5.4 DIE MUTANTE C572573A-HP2X7 ___________________________ 65 6 ZUSAMMENFASSUNG_________________________________________________ 66 7 LITERATURVERZEICHNIS _______________________________________________ 67 ANHANG_________________________________________________________ 77 A.L KLONIERTE CDNA-KONSTRUKTE__________________________________ 77 A.2 VERWENDETE LOESUNGEN UND PUFFER______________________________78 A.3 VORUNTERSUCHUNG ZUR MESSUNG EINER P2X7-VERMITTELTEN MEMBRAN- POREN-BILDUNG MITHILFE DER DURCHFLUSSZYTOMETRIE AN MONOZYTEN UND MAKROPHAGEN____________________________ 82 A.3.1 EINLEITUNG __________________________________________ 82 A.3.2 VERSUCHSAUFBAU______________________________________ 82 A.3.2.1 ISOLATION DER MONOZYTEN __________________________ 82 A.3.2.2 FLUORESZENZMESSUNG MITHILFE DER DURCHFLUSSZYTOMETRIE _ 83 A.3.3 ERGEBNISSE UND DISKUSSION _____________________________ 83 A.4 VORHERSAGE DER PALMITOYLIERUNGS-WAHRSCHEINLICHKEIT DER INTRAZELLULAEREN CYSTEINE MITHILFE DER SOFTWARE CSS PALM 4.0_____85 A.5 AUSGABE DER STATISTIK-SOFTWARE SPSS 15.0 _______________________ 86 A.5.1 EXPRESSION DER CYSTEIN-ZU-ALANIN-MUTANTEN DES P2X7R IN XENOPUS LAEVIS-OOZYXCN (SIEHE ABB. 4.2) ______________ 86 A.5.1.1 OBERFLAECHENEXPRESSION ___________________________ 86 A.5.1.2 GESAMTEXPRESSION _______________________________ 87 A.5.2 OBERFLAECHENEXPRESSION DER CYSTEIN-ZU-ALANIN-MUTANTEN DES P2X7R IN FLP-INT-REX-293-ZELLEN (SIEHE ABB. 4.8) __________ 88 A.5.2.1 ISOTYP-KONTROLLE ________________________________ 88 A.5.2.2 ANTI-P2X7-ANTIKOERPER __________________________ 89 DANKSAGUNG______________________________________________________ 90 ERKLAERUNG ZUR DATENAUFBEWAHRUNG ____________________________________ 91 ERKLAERUNG ZUM EIGENANTEIL __________________________________________ 92 LEBENSLAUF_______________________________________________________ 93
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