Nachweis tumorreaktiver Zellen aus dem Blut von Patientinnen mit Ovarialkarzinom:
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2005
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adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Immunantworten auf Tumoren 1
1.2 T-Zell-Aktivierung, Effektorfunktionen und T-Zell-vermittelte Cytotoxizität 1
1.3 Tumorantigene 4
1.4 Ovarialkarzinom 6
1.5 Immuntherapeutische Ansätze zur Behandlung von Tumoren 7
1.6 Immuntherapie beim Ovarialkarzinom 8
1.7 Methoden zum Nachweis tumorreaktiver Zellen 9
1.8 Zielsetzung und Fragestellung 12
2 Patienten, Material und Methoden 13
2.1 Patienten und Kontrollgruppen 13
2.2 Material 13
2.2.1 Tumorzelllinien 13
2.2.2 Phosphat-Puffer 13
2.2.3 Waschpuffer 13
2.2.4 Coating-Puffer 14
2.2.5 Kulturmedium 14
2.2.6 Tabelle häufig verwendeter Materialien 14
2.3 Methoden 15
2.3.1 Gewinnung von PBMCs aus heparinisiertem Vollblut 15
2.3.2 Bestimmung der Zellzahl 16
2.3.3 Gewinnung von Tumorzellen aus Aszitesflüssigkeit und Tumorresektaten.... 16
2.3.4 Kultur der Tumorzellen 17
2.3.5 Durchflusszytometrie 17
2.3.6 IFNy-Titration 17
2.3.7 IFNy ELISPOT-Assay 18
2.3.8 Isolierung von Lymphozyten-Subpopulationen (CD8+) 20
3 Ergebnisse 21
3.1 Etabliemng des ELISPOT-Slandardprotokolls 21
3.1.1 Titration des Bindungsantikörpers 21
3.1.2 Überprüfung des ELISPOTS anhand von bekannten Anligenen 24
3.1.3 Etablierung des Effektor-Target-Verhältnisses bei zellulärer Stimulation. 25
3.1.4 T-Zell-Antworten gegenüber allogenen Tumorzelllinien 26
3.1.5 IFNy-Stimulation der Tumorzellen 28
3.2 Charakterisierung der DFNy-sezernierenden Zellpopulation 29
3.2.1 Isolierung der CD8+ Lymphozytensubpopulation 30
3.3 Stimulation von PBMC mit autologen Tumorzellen 31
3.3.1 Gewinnung und Kryokonservierung von PBMCs 31
3.3.2 Primärtumorzellen 32
3.3.3 Nachweis tumorreaktiver Lymphozyten in Patientinnen mit
Ovarialkarzinom 33
3.3.4 Aussage über Frequenzen von tumorreaktiven Zellen 39
3.3.5 Vergleich der T-Zell-Antworten von gesunden Spendern mit den T-Zell-
Antworten von Patientinnen mit Ovarialkarzinom nach Stimulation mit der allogenen
Tumorzelllinie SCOV3 40
3.4 Korrelation von klinischen Parametern der Ovarialkarzinom-Patientinnen mit
Ergebnissen des ELISPOT-Assays 41
4 Diskussion 42
4.1 Etablierung eines modifizierten ELISPOT-Assays: Nachweis einer spezifischen
IFNy-Sekretion nach Stimulation mit autologen Tumorzellen 42
4.2 Signifikante tumorreaktive Immunreaktion bei Patientinnen mit Ovarialkarzinom 44
4.3 Frequenzen von tumorreaktiven Zellen bei Patientinnen mit Ovarialkarzinom 46
4.4 Beteiligung verschiedener Immunzellen an der Tumorerkennung und -abwehr 47
4.4.1 CD8+ zytotoxische Lymphozyten 48
4.4.2 CD4+ T-Lymphozyten 48
4.4.3 NK-Zellen 49
4.4.4 y5-T-Zellen 50
4.5 Diskrepanz zwischen Vorhandensein von Immunantwort gegen den Tumor und
ungehinderter Progression des Tumorwachstums 51
4.5.1 Beteiligung regulatorischer CD4+CD25+ T-Zellen an der Tumorprogression52
4.5.2 Das spezielle Mikroenviromment der Peritonealhöhle filhrt zu veränderten
Signaltransduktionswegen bei Lymphozyten 52
4.6 Klinischer Verlauf 53
5 Zusammenfassung 55
6 Literaturverzeichnis 58
7 Anhang 62
7.1 Patientinnentabelle 62
7.2 Abkürzungen 62
8 Danksagung 64
9 Lebenslauf 65
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Immunantworten auf Tumoren 1
1.2 T-Zell-Aktivierung, Effektorfunktionen und T-Zell-vermittelte Cytotoxizität 1
1.3 Tumorantigene 4
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2.3.1 Gewinnung von PBMCs aus heparinisiertem Vollblut 15
2.3.2 Bestimmung der Zellzahl 16
2.3.3 Gewinnung von Tumorzellen aus Aszitesflüssigkeit und Tumorresektaten. 16
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3.2 Charakterisierung der DFNy-sezernierenden Zellpopulation 29
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3.3 Stimulation von PBMC mit autologen Tumorzellen 31
3.3.1 Gewinnung und Kryokonservierung von PBMCs 31
3.3.2 Primärtumorzellen 32
3.3.3 Nachweis tumorreaktiver Lymphozyten in Patientinnen mit
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3.3.5 Vergleich der T-Zell-Antworten von gesunden Spendern mit den T-Zell-
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Tumorzelllinie SCOV3 40
3.4 Korrelation von klinischen Parametern der Ovarialkarzinom-Patientinnen mit
Ergebnissen des ELISPOT-Assays 41
4 Diskussion 42
4.1 Etablierung eines modifizierten ELISPOT-Assays: Nachweis einer spezifischen
IFNy-Sekretion nach Stimulation mit autologen Tumorzellen 42
4.2 Signifikante tumorreaktive Immunreaktion bei Patientinnen mit Ovarialkarzinom 44
4.3 Frequenzen von tumorreaktiven Zellen bei Patientinnen mit Ovarialkarzinom 46
4.4 Beteiligung verschiedener Immunzellen an der Tumorerkennung und -abwehr 47
4.4.1 CD8+ zytotoxische Lymphozyten 48
4.4.2 CD4+ T-Lymphozyten 48
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4.5 Diskrepanz zwischen Vorhandensein von Immunantwort gegen den Tumor und
ungehinderter Progression des Tumorwachstums 51
4.5.1 Beteiligung regulatorischer CD4+CD25+ T-Zellen an der Tumorprogression52
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