Lokalisierung der regulatorischen leichten Kette auf der schweren Kette und ihre Wechselwirkungen im Myosin des Skelettmuskels:
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INHALTSVERZEICHNIS
A.
EINLEITUNG
1
1.
MOLEKULARER
AUFBAU
DER
SKELETTMUSKULATUR
1
2.
MECHANISMUS
UND
STEUERUNG
DER
MUSKELKONTRAKTION
5
3.
DIE
REGULATORISCHE
LEICHTE
KETTE
DES
MYOSINS
ALS
CA
++
-BINDENDES
PROTEIN
7
4.
BEDEUTUNG
DER
REGULATORISCHEN
LEICHTEN
KETTE
IM
SKELETTMUSKEL
9
B.
PROBLEMSTELLUNG
11
C.
SEQUENZEN
13
A)
AMINOSAEURENSEQUENZ
DER
REGULATORISCHEN
LEICHTEN
KETTE
(RLC)
VOM
MYOSIN
AUS
DEM
SKELETTMUSKEL
DES
KANINCHENS
13
B)
AMINOSAEURENSEQUENZ
DER
MYOSIN-HC
VON
1-809
VOM
MYOSIN
AUS
DEM
SKELETTMUSKEL
DES
KANINCHENS
14
C)
AMINOSAEURENSEQUENZ
VON
VERWENDETEN
MODELLPEPTIDEN
15
D.
METHODEN
16
1.
PRAEPARATIONEN
16
1.1.
MUSKELMATERIAL
16
1.2.
PRAEPARATION
VON
MYOSIN
16
1.3.
PRAEPARATIONEN
VON
SUBFRAGMENTEN
(SL)
UND
UNTEREINHEITEN
AUS
DEM
MYOSIN
17
1.3.1.
PRAEPARATION
DER
REGULATORISCHEN
LEICHTEN
KETTE
(RLC)
17
1.3.2.
PRAEPARATION
VON
MYOSIN-SUBFRAGMENT
1
(CHYMO-SL)
MIT
CHY
MOTRYPSIN
18
1.3.3.
PRAEPARATION
VON
MYOSIN-SUBFRAGMENT
1
(PAP-S
1)
MIT
PAPAIN
18
1.3.4.
PRAEPARATION
DER
SCHWEREN
KETTEN
(HC)
VON
CHYMO-SL
19
1.4.
PRAEPARATION
VON
DESENSIBILISIERTEM
ACTOMYOSIN
(DAM)
20
1.5.
PRAEPARATION
VON
MYOSIN
IM
DAM
MIT
ENTFERNTER
RLC
21
1.5.1.
ENTFERNUNG
DER
RLC
VOM
MYOSIN
IM
DAM
MIT
DTNB
21
1.5.2.
ENTFERNUNG
DER
RLC
VOM
MYOSIN
IM
DAM
MIT
DTNB
UND
CHY
MOTRYPSIN
21
2.
NACHWEISMETHODEN
22
2.1.
PROTEINBESTIMMUNGEN
22
2.1.1.
PROTEINBESTIMMUNG
VON
MYOSIN
UND
DAM
22
2.1.2.
PROTEINBESTIMMUNG
VON
CHYMO-SL,
PAP-SL,
RLC
UND
CYTOCHROM
C
22
2.1.3.
LOKALISIERUNG
VON
PROTEINEN
UND
PEPTIDEN
IN
SAEULENELUATEN
23
2.2.
BESTIMMUNG
DER
ENZYMATISCHEN
AKTIVITAETEN
VON
MYOSIN,
DAM
UND
VON
S
1
-PRAEPARATIONEN
23
2.3.
MESSUNG
VON
EINGEBAUTER
RADIOAKTIVITAET
IN
PROTEINEN
UND
PEPTIDEN
26
2.4.
SDS-GELELEKTROPHORESE
26
2.4.1.
KONTINUIERLICHE
SDS-GELELEKTROPHORESE
IN
RUND-UND
FLACHGELEN
26
2.4.2.
DISKONTINUIERLICHE
SDS-GELELEKTROPHORESE
IN
FLACHGELEN
28
2.4.3.
AUFBEREITUNG
DER
PROTEINPROBEN
FUER
DIE
SDS-GELELEKTROPHORESE
28
2.4.4.
BESTIMMUNG
DES
MOLEKULARGEWICHTS
VON
AUFGETRENNTEN
PROTEINEN
UND
PEPTIDEN
IN
FLACHGELEN
29
2.5.
SPEKTROSKOPISCHE
MESSUNGEN
DER
ISOLIERTEN
RLC
IM
ULTRAVIOLETTEN
WELLENLAENGENBEREICH
29
3.
CHROMATOGRAPHISCHE
METHODEN
30
3.1.
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
UND
PEPTIDEN
IN
DER
GELFILTRATIONSCHRO
MATOGRAPHIE
30
3.2.
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
VON
PEPTIDEN
UND
AMINOSAEUREN
IN
DER
KATIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
31
4.
CHEMISCHE
MODIFIKATIONEN
VON
PROTEINEN
32
4.1.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
CHYMO-SL
AN
DEN
PRIMAEREN
AMINO
GRUPPEN
32
4.2.
INTRAMOLEKULARE
VERKNUEPFUNG
DER
BEIDEN
CYSTEINE
IN
DER
RLC
DURCH
DIE
EINFUEHRUNG
EINER
DISULFIDBRUECKE
ODER
MIT
BIFUNKTIONELLEN
THIOLREAGENZIEN
32
A)
IM
MYOSIN
UND
IM
ACTOMYOSINKOMPLEX
32
B)
IN
DER
ISOLIERTEN
RLC
34
4.3.
QUANTITATIVE
UND
LIMITIERTE,
SELEKTIVE
MODIFIZIERUNG
DER
RLC
AN
DEN
CYSTEINEN
34
A)
IM
MYOSIN
34
B)
IN
DER
ISOLIERTEN
RLC
35
4.4.
SPEZIFISCHE
MODIFIKATION
VON
CYSTEIN-697
UND
CYSTEIN-707
IM
MYOSIN,
CHYMO-SL
UND
PAP-SL
35
5.
CHEMISCHE
UND
ENZYMATISCHE
SPALTUNG
VON
PROTEINEN
36
5.1.
CHEMISCHE
SPALTUNG
DER
RLC
UND
DER
HC
VON
CHYMO-SL
AN
DEN
CYSTEINEN
36
5.2.
CHEMISCHE
SPALTUNG
DER
RLC
AM
TRYPTOPHAN
37
5.3.
VERDAUUNG
DER
HC
VON
CHYMO-SL
MIT
CARBOXYPEPTIDASE
A
UND
BESTIMMUNG
DER
FREIGESETZTEN
AMINOSAEUREN
38
6.
REKOMBINATION
VON
NATIVER
UND
MODIFIZIERTER
RLC
UND
DEREN
FRAG
MENTE
MIT
MYOSIN
IM
DAM
NACH
ENTFERNUNG
DER
ENDOGENEN
RLC
38
E.
RESULTATE
40
1.
PROTEINPRAEPARATIONEN
AUS
DEM
SCHNELLEN
SKELETTMUSKEL
DES
KANIN
CHENS
40
2.
REAKTIVITAET
DER
BEIDEN
CYSTEINE
IN
DER
RLC
42
2.1.
QUANTITATIVE
MODIFIKATION
DER
THIOLGRUPPEN
IN
DER
ISOLIERTEN
RLC
UND
IM
MYOSIN
42
2.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
UNTERSCHIEDLICHEN
REAKTIONSEIGENSCHAFTEN
DER
BEIDEN
THIOLGRUPPEN
IN
DER
ISOLIERTEN
RLC
45
2.3.
BILDUNG
EINER
DISULFIDBRUECKE
ZWISCHEN
DEN
BEIDEN
THIOLGRUPPEN
DER
RLC
48
3.
BILDUNG
EINER
INTRAMOLEKULAREN
PEPTIDSCHLAUFE
IN
DER
RLC
UND
IHRE
AUSWIRKUNGEN
AUF
DEREN
STRUKTUR
UND
FUNKTION
50
3.1.
BILDUNG
EINER
INTRAMOLEKULAREN
PEPTIDSCHLAUFE
MIT
DTNB
UND
VER
SCHIEDEN
LANGEN
BIFUNKTIONELLEN
THIOLREAGENZIEN
IN
DER
RLC
AM
MYOSIN
50
3.2.
QUERVEMETZUNG
VON
RLC
UND
MYOSIN-HC
SOWIE
ZWISCHEN
DEN
BEIDEN
HC
EINES
MYOSINMOLEKUELS
MIT
DTNB
UND
VERSCHIEDENEN
BIFUNKTIONELLEN
THIOLREAGENZIEN
52
3.3.
AUSWIRKUNGEN
DER
MODIFIZIERUNG
VON
THIOLGRUPPEN
DES
MYOSINS
AUF
DIE
ATPASE-AKTIVITAETEN
56
3.4.
REAKTIONSEIGENSCHAFTEN
DER
THIOLGRUPPEN
IN
DER
ISOLIERTEN
RLC
61
3.5.
EINFLUSS
DER
CA
++
-BINDUNG
AUF
DIE
KONFORMATION
DER
ISOLIERTEN
RLC
64
3.6.
AUSWIRKUNG
DER
INTRAMOLEKULAREN
PEPTIDSCHLAUFE
DER
RLC
AUF
IHRE
BINDUNG
IM
MYOSIN
69
3.6.1.
ENTFERNUNG
DER
RLC
MIT
INTRAMOLEKULARER
PEPTIDSCHLAUFE
AUS
DEM
MYOSIN
69
3.6.2.
REKOMBINATION
EXOGENER
RLC
MIT
UND
OHNE
INTRAMOLEKULARER
PEPTIDSCHLAUFE
MIT
DER
MYOSIN-HC
71
YY4.
PRAEPARATION
VON
RLC-FRAGMENTEN
UND
REKOMBINATION
DER
FRAGMEN
TE
SOWIE
VON
CHEMISCH
MODIFIZIERTER
RLC
MIT
DEN
SCHWEREN
KETTEN
DES
MYOSINS
74
4.1.
PRAEPARATION
VON
RLC-FRAGMENTEN
74
4.1.1. SPALTUNG
DER
RLC
AM
TRYPTOPHAN
74
4.1.2.
SPALTUNG
DER
RLC
AN
DEN
CYSTEINEN
76
4.2.
PRAEPARATION
UND
ISOLIERUNG
DES
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
4,8
KDA
GROS
SEN
C-TERMS
DER
RLC
NACH
SPALTUNG
MIT
NTCB
80
4.3.
REKOMBINATION
VON
RLC-FRAGMENTEN
UND
VON
CHEMISCH
MODIFIZIER
TER
RLC
MIT
DER
MYOSIN-HC
85
5.
LOKALISIERUNG
DER
BINDUNGSREGION
DER
RLC
AUF
DER
MYOSIN-HC
91
5.1.
BESTIMMUNG
DER
C-TERMINALEN
AMINOSAEUREN
DER
HC
VON
CHYMO-S
1
91
5.2.
ISOLIERUNG
UND
IDENTIFIZIERUNG
EINES
C-TERMINALEN
PEPTIDS
AUS
DER
HC
VON
CHYMO-S
1
94
5.2.1.
PRAEPARATION
VON
SPEZIFISCHEN
PEPTIDEN
DER
HC
VON
CHYMO-S
1
94
5.2.2.
GELFILTRATIONS
UND
KATIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
VON
MO
DELLPEPTIDEN
97
5.2.3.
PRAEPARATION
UND
REINIGUNG
DES
C-TERMINALEN
PEPTIDS
NACH
SPALTUNG
MIT
NTCB
102
5.2.4.
IDENTIFIZIERUNG
DES
C-TERMINALEN
NTCB-PEPTIDS
104
F.
DISKUSSION
107
1.
DIE
REAKTIVITAET
DER
BEIDEN
CYSTEINE
IN
DER
RLC
107
2.
AUSWIRKUNGEN
DER
CA
++
-BINDUNG
AUF
DIE
KONFORMATION
DER
RLC
AM
MYOSIN
UND
IN
DER
ISOLIERTEN
FORM
108
3.
BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
DER
RLC
MIT
DER
MYOSIN-HC
111
4.
LOKALISIERUNG
DER
BINDUNGSSTELLE
DER
RLC
AUF
DER
MYOSIN-HC
114
G.
ZUSAMMENFASSUNG
122
H.
SUMMARY
125
I.
VERWENDETE
ABKUERZUNGEN
UND
VERZEICHNIS
DER
AMINOSAEUREN
127
K.
LITERATURVERZEICHNIS
129
DANK
LEBENSLAUF |
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