Das leukämische Fusionsprotein AML1-ETO erhöht die Expression des Transkriptionsfaktors und Protoonkogens c-Jun:
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Autor: Franzen, Michael
Jahr: 2008
INHALTSVERZEICHNIS |
INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung 1
1.1 Akute myeloische Leukämie (AML) und Hämatopoese 1
1.2 Die Translokation t(8;21) und das Fusionsprotein AML1-ETO 9
1.3 Das Protoonkogen c-Jun 14
1.4 Fragestellung 17
2 Material und Methoden 19
2.1 Materialien 19
2.1.1 Reagenzien 19
2.1.2 Reaktionskits 20
2.1.3 Enzyme und Marker 20
2.1.4 Laborgeräte und Verbrauchsmaterial 21
2.1.5 Puffer und Lösungen 22
2.1.6 Expressionsvektoren, Reporterkonstrukte und Primer 24
2.1.6.1 Eukaryotische Expressionsvektoren 24
2.1.6.2 Reporterkonstrukte 25
2.1.6.3 Primer 26
2.1.7 Antikörper 26
2.1.8 Verwendete Zelllinien und Bakterien 27
2.1.9 Kulturmedien 29
2.1.9.1 Bakterien 29
2.1.9.2 Suspensionszellen 29
2.2 Methoden 31
2.2.1 Zellkultur 31
2.2.1.1 Kulturbedingungen für Suspensionszellen 31
2.2.1.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen 31
2.2.1.3 Bestimmung der Zellzahl 32
2.2.2 Transiente Transfektionen 32
2.2.2.1 DNA-Präparation 33
II INHALTSVERZEICHNIS II
2.2.2.2 Elektroporation 33
2.2.2.3 Effectene® 33
2.2.2.4 Dual-Luciferase® Reporter Assay 34
2.2.3 Western Blot 36
2.2.3.1 Gewinnung der Zell-Lysate 36
2.2.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration 36
2.2.3.3 In vitro Translation 37
2.2.3.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 37
2.2.3.5 Western Blot 38
2.2.3.6 Stripping-Verfahren 39
2.2.3.7 Densitometrsiche Messung 39
2.2.4 Realtime PCR 40
2.2.4.1 RNA-Extraktion 40
2.2.4.2 cDNA-Synthese 40
2.2.4.3 Realtime-Polymerase-Kettenreaktion 41
2.2.5 MTT Proliferationsassay 43
3 Ergebnisse 45
3.1 AML1-ETO erhöht die Aktivität des vollständigen humanen c-Jun
Promotors 45
3.2 Die Aktivierung des c-Jun Promotors durch AML1-ETO ist j
dosisabhängig 4g
3.3 AML1 und CBFß führen nicht zu einer Transaktivierung des c-Jun
Promotors jq
3.4 Für die Transaktivierung des c-Jun Promotors durch AML1-ETO ist
die proximale AP-1 Bindungsstelle entscheidend 52 !
3.4.1 Verschiedene Deletionskonstrukte des c-Jun Promotors sind
transkriptioneil aktiv 52
3.4.2 AML1-ETO erhöht die transkriptionelle Aktivität verschiedener j
Deletionskonstrukte des c-Jun Promotors 53 j
3.4.3 Wichtige Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen im proximalen :
c-Jun Promotor «
INHALTSVERZEICHNIS |||
3.4.4 Die proximale AP-1 Bindungsstelle ist für die Transaktivierung
des c-Jun Promotors durch AML1-ETO verantwortlich 57
3.5 AML1-ETO und c-Jun kooperieren an der proximalen AP-1
Bindungsstelle des c-Jun Promotors 60
3.6 AML1-ETO und c-Jun kooperieren am AML1 Promotor, der die
Expression von AML1-ETO reguliert 62
3.7 Die Expression von AML1-ETO in einer Tetracyclin-induzierbaren
Zelllinie erhöht die c-Jun mRNA-Expression 65
3.8 AML1-ETO erhöht die c-Jun Protein Expression in U937 Zellen 68
3.9 Überexpression von AML1-ETO vermindert die Proliferation von
U937 Zellen 72
4 Diskussion 75
4.1 AML1-ETO und c-Jun 75
4.2 Leukämie-Entstehung - Blockierung der Differenzierung durch
AML1-ETO 79
4.3 Leukämie-Entstehung - Proliferation und AML1-ETO 82
5 Zusammenfassung 85
6 Literaturverzeichnis 87
7 Abkürzungsverzeichnis 103
8 Danksagungen 105
9 Lebenslauf 107
10 Erklärung nach § 2 108
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