Untersuchungen zur Autophagieinduktion in Leishmania major-infizierten Knochenmarksmakrophagen: = Analyses of autophagy induction in Leishmania major-infected bone marrow-derived macrophages
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Würzburg
September 2015
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|---|---|
| adam_text | AUS DEM INSTITUT FUER MOLEKULARE INFEKTIONSBIOLOGIE
DER UNIVERSITAET WUERZBURG
VORSTAND: PROF. DR. JOERG VOGEL
UNTERSUCHUNGEN ZUR AUTOPHAGIEINDUKTION IN
LEISHMANIA WA/OR-INFIZIERTEN KNOCHENMARKSMAKROPHAGEN
INAUGURAL - DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DER DOKTORWUERDE DER
MEDIZINISCHEN FAKULTAET
DER
JULIUS-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET WUERZBURG
VORGELEGT VON
BENJAMIN FRANK
AUS STIMPFACH
WUERZBURG, SEPTEMBER 2015
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG........................................................................................................................1
1.1
LEISHMANIOSE.............................................................................................................1
1.1.1
ALLGEMEINES........................................................................................................1
1.1.2 LEBENSZYKLUS DER LEISHMANIEN
.........................................................................
1
1.1.3 FORMEN DER
LEISHMANIOSE.................................................................................
4
1.1.4 DERZEITIGE BEHANDLUNG DER
LEISHMANIOSE.........................................................6
1.2
AUTOPHAGIE...............................................................................................................
7
1.2.1 ALLGEMEINES ZUR
AUTOPHAGIE.............................................................................7
1.2.2 AUTOPHAGIE IN
INFEKTIONSKRANKHEITEN................................................................9
1.3 ZIELSETZUNG DER VORLIEGENDEN ARBEIT
......................................................................
11
2 MATERIAL UND
METHODEN................................................................................................
13
2.1 MATERIALIEN UND GERAETE
..........................................................................................
13
2.1.1 ALLGEMEINE CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN
......................................................
13
2.1.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN UND KITS
......................................................................
14
2.1.3
GERAETE...............................................................................................................15
2.1.4 ANTIKOERPER UND SIRNAS
...................................................................................
16
2.1.5 MEDIEN UND
PUFFER...........................................................................................
17
2.1.6 VERWENDETE LEISHMANIEN-STAEMME, ZELLLINIEN UND VERSUCHSTIERE
...................
19
2.1.7
SOFTWARE..........................................................................................................
20
2.2
METHODEN...............................................................................................................
20
2.2.1
ZELLKULTURMETHODEN.........................................................................................20
2.2.1.1 KULTIVIERUNG VON
L. M.
PROMASTIGOTEN.....................................................20
2.2.1.2 ERNTE UND BESTIMMUNG DER ZELLZAHL VON L M. PROMASTIGOTEN
..................
21
2.2.1.3 KULTIVIERUNG UND GEWINNUNG DES UEBERSTANDS VON
L929-ZELLEN...............21
2.2.1.4 GENERIERUNG VON BMDM AUS S Z
.............................................................22
2.2.1.5 INFEKTION VON BMDM MIT
L. M. PROMASTIGOTEN.......................................23
2.2.1.6 AUTOPHAGIEINDUKTION IN NICHT-INFIZIERTEN
BMDM....................................24
2.2.2
LICHTMIKROSKOPIE............................................................................................
24
2.2.2.1 BESTIMMUNG DER INFEKTIONSRATE IN L. M.-INFIZIERTEN BMDM
...................
24
2.2.2.2 BESTIMMUNG DES NUKLEUS-KINETOPLAST-ABSTANDS IN L. M.-INFIZIERTEN
BMDM.................................................................................................................
25
2.2.3 TEM
................................................................................................................
25
2.2.3.1 EINBETTUNG DER PROBEN FUER
TEM............................................................25
2.23.2 ERSTELLUNG EINES SEMIQUANTITATIVEN SCORES ZUR AUTOPHAGIEMESSUNG
...
27
2.2.3.3 ELEKTRONENTOMOGRAFIE
...........................................................................
28
2.2.4
TRANSKRIPTOMANALYSEN.....................................................................................28
2.2.4.1 ISOLATION VON RNA AUS
L. M.-INFIZIERTEN BMDM
...................................
28
2.2.4.2 HYBRIDISIERUNG VON AFFYMETRIX
MICROARRAYS...........................................29
2.2.4.3 BIOINFORMATISCHE AUFBEREITUNG DER MICROARRAY-DATEN
...........................
30
2.2.5
WESTERN-BLOT-ANALYSEN...................................................................................
30
2.2.5.1 GEWINNUNG VON
PROTEINLYSATEN.................................................................30
2.2.5.2 HERSTELLUNG DER
SDS-PAGE-GELE............................................................31
2.2.5.3 AUFBAU UND DURCHFUEHRUNG DER WESTERN
BLOTS..........................................32
2.2.6 HERUNTERREGULATION DER GENEXPRESSION MIT
SIRNA.........................................33
2.2.7 STATISTISCHE
METHODEN.....................................................................................34
3
ERGEBNISSE.....................................................................................................................
36
3.1 AUTOPHAGIEINDUKTION IN L. M.-INFIZIERTEN
BMDM.................................................36
3.1.1 TEM UNTERSUCHUNGEN ZUR
AUTOPHAGIEINDUKTION............................................36
3.1.2 UNTERSUCHUNG DER AUTOPHAGIEINDUKTION MIT LC3B
WESTERN-BLOT-ANALYSEN 39
3.2 VERDAU VON
L. M. PARASITEN IN BMDM
................................................................
43
3.3 UNTERSUCHUNG WEITERER AUTOPHAGIERELEVANTER PROTEINE
.........................................
44
3.3.1 UNTERSUCHUNGEN DER EXPRESSION VON
ATG5....................................................45
3.3.2 UNTERSUCHUNGEN DER EXPRESSION VON U B
.......................................................
47
3.4 ROLLE VON MLS IM VERDAU VON
L. M. PARASITEN
...................................................
47
3.5 IDENTIFIKATION INFEKTIONSSPEZIFISCHER
GENE............................................................50
3.5.1 ERSTELLUNG EINES NETZWERKS AUS AUTOPHAGIERELEVANTEN GENEN
.......................
50
3.5.2 IDENTIFIKATION WEITERER INFEKTIONSSPEZIFISCHER AUTOPHAGIEGENE
.....................
53
3.6 UNTERSUCHUNG VON BNIP3 UND CTSE ALS AUTOPHAGIERELEVANTE PROTEINE
.............
54
3.6.1 UNTERSUCHUNGEN DER EXPRESSION VON
BNIP3...................................................54
3.6.2 UNTERSUCHUNGEN DER EXPRESSION VON
CTSE....................................................58
3.7 ENTWICKLUNG DES TOTALEN AUTOPHAGIESCORES WAEHREND DER
L. M. INFEKTION
......
.
59
4
DISKUSSION....................................................................................................................
61
5
ZUSAMMENFASSUNG........................................................................................................
68
6
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS................................................................................................
70
7
LITERATURVERZEICHNIS......................................................................................................
74
8 ABBILDUNGS- UND
TABELLENVERZEICHNIS..........................................................................79
9
ANHANG.........................................................................................................................
80
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