Charakterisierung und Hedgehog-Signaltransduktion in murinen Leukämien und Myeloproliferativen Neoplasien:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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Freiburg im Breisgau
[2018]
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG
1.1 DIE HAEMATOPOESE
1.2 DIE HAEMATOPOETISCHE STAMMZELLE
1.3 DIE LEUKAEMISCHE STAMMZELLE
1.4 DIE AKUTE MYELOISCHE LEUKAEMIE
1.4.1 EPIDEMIOLOGIE
1.4.2 DIAGNOSTIK UND KLASSIFIZIERUNG
1.4.3 FRENCH-AMERICAN-BRITISH-KLASSIFIKATION
1.4.4 WORLD-HEALTH-ORGANISATION-KLASSIFIKATION
1.4.5 PROGNOSE
1.4.6 FUSIONSGENE
1.4.7 DIE *SECOND -HIT*-HYPOTHESE IN DER LEUKAEMIEENTSTEHUNG
1.5 DIE MYELOPROLIFERATIVE NEOPLASIE
1.5.1 POLYZYTHAEMIA RUBRA VERA
1.5.2 EPIDEMIOLOGIE
1.5.3 DIAGNOSE UND DIFFERENTIALDIAGNOSE
1.5.4 MOLEKULARE APEKTE
1.5.4.1 DIE JAK2V617F MUTATION
1.5.5 THERAPIE UND PROGNOSE
1.6 DER HEDGEHOG-SIGNALWEG
1.6.1 DIE HEDGEHOG-SIGNALTRANSDUKTION
1.6.2 DIE ROLLE DES HEDGEHOG-SIGNALWEGES IN DER TUMORGENESE
1.6.3 DER HEDGEHOG-SIGNALWEG IM TUMORSTAMMZELLMODELL
2 ZIELE DES PROJEKTES/FRAGESTELLUNG DER DISSERTATION
3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 MATERIAL
3.1.1 GERAETE
3.1.2 LABORMATERIALIEN
3.1.3 CHEMIKALIEN
3.1.4 REAKTIONSSYSTEMANSAETZE
3.1.5 ZELLLINIEN
3.1.6 BAKTERIENSTAEMME
3.1.7 KONSTRUKTE
3.1.8 OLIGODESOXYRIBONUKLEOTIDE
3.1.9 KULTURSEREN
V
1
1
2
3
4
5
5
6
6
7
8
9
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22
22
24
26
29
29
29
30
30
31
3.1.10 KULTURMEDIEN 31
3.1.11 ENZYME UND PUFFER 32
3.1.12 MARKER 32
3.1.13 ZYTOKINE 32
3.1.14 ANTIKOERPER 33
3.1.15 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 33
3.1.15.1 IMMUNHISTOCHEMIE 34
3.1.16 EDV 34
3.2 METHODEN 35
3.2.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 35
3.2.1.1 KULTIVIERUNG DER 2931- UND WEHI-3B ZELLEN 35
3.2.1.2 EINFRIEREN UND AUFTAUEN DER ZELLEN 35
3.2.1.3 ISOLATION VON KNOCHENMARK-, MILZ- UND LYMPHKNOTENZELLEN 36
3.2.1.4 ERYTHROZYTENLYSE 3 6
3.2.1.5 ZELLZAEHLUNG 36
3.2.1.6 PRODUKTION VON REKOMBINANTEM RETROVIRUS 37
3.2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 38
3.2.2.1 RNA-ISOLIERUNG 38
3.2.2.2 CDNA-SYNTHESE 38
3.2.2.3 DNA-AMPLIFIKATION MITTELS POLYMERASE-KETTENREAKTION 39
3.2.2.4 TAQMAN-PCR 39
3.2.2.5 DNA-VERMEHRUNG 40
3.2.2.6 MAXIPRAEPARATION VON PLASMID DNA 41
3.2.2.? RESTRIKTION VON VIRALEN DNA-VEKTOREN 41
3.2.2.8 AUFTRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN DURCH AGAROSE- GELELEKTROPHORESE
42
3.2.2.9 DNA-SEQUENZIERUNG 42
3.2.3 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 42
3.2.3.1 OBERFLAECHENMARKER 43
3.2.3.2 FAERBEPANEL 43
3.2.4 HISTOPATHOLOGIE 44
3.2.4.1 KONVENTIONELLE HISTOLOGISCHE FAERBUNGEN 44
3.2.4.2 IMMUNHISTOCHEMIE 45
3.2.5 TIEREXPERIMENTELLE METHODEN 46
3.2.5.1 VERSUCHSTIERE 46
3.2.5.2 TIERHALTUNG 46
3.2.5.3 GENOTYPISIERUNG DER MAEUSE 47
3.2.5.4 BLUTGEWINNUNG UND-ANALYSE 47
3.2.5.5 ORGANGEWINNUNG 47
3.2.5.6 MURINES TRANSPLANTATIONSMODELL 48
3.2.5.7 MURINES RETRANSPLANTATIONSMODELL 50
3.2.5.8 GENETISCHER KNOCKOUT DES HEDGEHOG-SIGNALWEGES IN DER JAK2V617F
POSITIVEN
MYELOPROLIFERATIVEN NEOPLASIE 50
3.2.5.9 PHARMAKOLOGISCHER KNOCKOUT DES HEDGEHOG-SIGNALWEGES IN MURINEN
AKUTEN LEUKAEMIEN
UND MYELOPROLIFERATIVEN NEOPLASIEN 51
3.2.6 STATISTISCHE AUSWERTUNG 52
4 ERGEBNISSE 53
4.1 DAS MURINE KNOCHENMARKTRANSPLANTATIONSMODELL 53
4.2 DIE PRIMAERTRANSPLANTATION 54
4.2.1 PHAENOTYPISCHE UNTERSCHIEDE DER FUSIONSONKOGENE 54
4.2.2 PHAENOTYPEN IM DIFFERENTIALBLUTBILD 55
4.2.3 UEBERLEBENSDATEN DER PRIMAERTRANSPLANTATION 57
4.2.4 VERGLEICH DER KOERPER- UND ORGANGEWICHTE 58
4.2.5 HISTOPATHOLOGISCHE UNTERSCHIEDE DER ONKOGEN-INDUZIERTEN AKUTEN
LEUKAEMIEN UND
MYELOPROLIFERATIVEN NEOPLASIEN 59
4.2.6 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSE DER KNOCHENMARK- UND MILZZELLEN IN
ONKOGEN-INDUZIERTEN
LEUKAEMIEN UND MYELOPROLIFERATIVEN NEOPLASIEN 76
4.2.6.1 GFP-EXPRESSION 76
4.2.6.2 VERGLEICH DES T-ZELLKOMPARTIMENTES 77
4.2.6.Z VERGLEICH DES B-ZELLKOMPARTIMENTES 79
4.2.6.4 VERGLEICH DER MYELOMONOZYTAEREN ZELLEN 80
4.2.6.5 ERYTHROIDE PROGENITOREN 81
4.2.6.6 VERGLEICH DES PROGENITOR- UND STAMMZELLKOMPARTIMENTES 82
4.2.6.7 ONKOGEN-INDUZIERTE DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE VERAENDERUNGEN DER
ZELLKOMPARTIMENTE IN
KNOCHENMARK UND MILZ 83
4.3 TRANSPLANTATION VON PRIMAEREN KNOCHENMARKZELLEN ONKOGEN-INDUZIERTER
LEUKAEMIEN UND MYELOPROLIFERATIVER NEOPLASIEN 88
4.3.1 PHAENOTYPEN DER RETRANSPLANTATION 88
4.3.2 DIFFERENTIALBLUTBILD DER RETRANSPLANTATION IM VERGLEICH ZUR
PRIMAERTRANSPLANTATION 89
4.3.3 UEBERLEBENSDATEN DER RETRANSPLANTATION 93
4.3.4 ORGANGEWICHTE IM VERGLEICH ZUR PRIMAERTRANSPLANTATION 95
4.4 AKTIVIERUNG DES HEDGEHOG-SIGNALWEGES IN ONKOGEN-INDUZIERTEN AKUTEN
LEUKAEMIEN UND MYELOPROLIFERATIVEN NEOPLASIEN 96
4.4.1 EXPRESSION DER HEDGEHOG-SIGNALWEG-PROTEINE IN KNOCHENMARK UND MILZ
97
4.4.1.1 DIE EXPRESSIONSLEVEI VON SHH/IHH/DHH UND SMO ZEIGEN KEINE
KORRELATION MIT DER
J EWEILIGEN GLI 1 EXPRESSION 101
4.4.2 GENEXPRESSIONSANALYSEN VON HEDGEHOG-SIGNALWEG-MEDIATOREN IN
KNOCHENMARK UND MILZ 101
4.5 SMO-INHIBITION IN VIVO IN DER MOZ-TIF2 POSITIVEN AKUTEN
MYELOMONOZYTAEREN
LEUKAEMIE 104
4.5.1 UNTER SMO-INHIBITION ZEIGT SICH EIN SIGNIFIKANTER RUECKGANG DER
NEUTROPHILIE IM PERIPHEREN
BLUT 105
4.5.2 SMO-INHIBITION IN VIVO INDUZIERT EINE MILDE REDUKTION DER
ORGANOMEGALIE 106
4.5.3 IPI-926 FUHRT ZU EINER SPEZIFISCHEN REDUKTION DER MOZ-TIF2
POSITIVEN STAMMZELLEN UND
MYELOISCHEN PROGENITOREN IN KNOCHENMARK- UND MILZZELLEN 107
4.6 PHARMAKOLOGISCHE INHIBITION DES HEDGEHOG-SIGNALWEGES IN VIVO IN DER
JAK2V617F POSITIVEN MYELOPROLIFERATIVEN NEOPLASIE 111
4.6.1 SMO-INHIBITION IN VIVO FUHRT ZU EINER SIGNIFIKANTEN REDUKTION DER
NEUTROPHILEN GRANULOZYTEN
IM DIFFERENTIALBLUTBILD 112
4.6.2 SMO-INHIBITION IN VIVO INDUZIERT EINE MILDE REDUKTION DER
SPLENOMEGALIE 113
4.6.3 IPI-926 FUHRT ZU KEINER REDUKTION DER OSTEOBLASTEN JAK2V617F
POSITIVER TIERE 114
4.6.4 SMO-INHIBITION FUHRT ZU EINER SPEZIFISCHEN REDUKTION DER JAK2V617F
POSITIVEN
MYELOISCHEN PROGENITOREN UND REIFEN MYELOISCHEN ZELLEN 115
4.7 SMO-INHIBITION IN VIVO VERZOEGERT DIE RETRANSPLANTIERBARKEIT DER
MURINEN
JAK2V617F POSITIVEN MYELOPROLIFERATIVEN NEOPLASIE 117
4.8 ADDITIVE CHEMOTHERAPEUTIKA IN DER THERAPIE DER JAK2V617F POSITIVEN
MYELOPROLIFERATIVEN NEOPLASIE 121
4.8.1 CYTARABIN LOOMG/KGKG REDUZIERT SIGNIFIKANT DIE JAK2V617F
POPULATION IN DER MILZ OHNE
ERKENNBARE TOXIZITAET 122
4.8.2 ARAC 200MG/KGKG UND IFNA 3000 I.E. VERHINDERN SPEZIFISCH DIE
AUSBREITUNG DER
JAK2V617F POPULATION OHNE ERKENNBARE TOXIZITAET 123
4.8.3 ARAC 200MG/KGKG UND IFNA 3000 I.E. REDUZIEREN DIE JAK2V617F
POSITIVE POPULATION IM
KNOCHENMARK UEBER EINE REDUKTION DER MYELOISCHEN UND ERYTHROIDEN
PROGENITOREN 126
4.8.4 DIE KOMBINATION VON IPI-926 UND IFNA FUEHRT UNTER LETALER TOXIZITAET
ZU EINER SIGNIFIKANTEN
REDUKTION DER JAK2V617F POSITIVEN POPULATION IM PERIPHEREN BLUT 127
4.9 GENETISCHER KNOCKOUT DES HEDGEHOG-SIGNALWEGES IN DER JAK2V617F
POSITIVEN
MYELOPROLIFERATIVEN NEOPLASIE 129
4.9.1 NACH TRANSPLANTATION JAK2V617F POSITIVER SMO+/- FETALER
LEBERZELLEN KOMMT ES ZU EINER
VERLANGSAMTEN REGENERATION DER FRUEHEN HAEMATOPOESE 129
4.9.2 JAK2V617F TRANSDUZIERTE SMO +/+ UND SMO +/- FETALE LEBERZELLEN
INDUZIEREN LETALE
AKUTE LEUKAEMIEN UND MYELOPROLIFERATIVE NEOPLASIEN 130
4.9.3 JAK2V617F TRANSFORMIERT BIPOTENTE VORLAEUFERZELLEN DER FETALEN
HAEMATOPOESE 132
5 DISKUSSION 135
5.1 PHAENOTYPISIERUNG DER ONKOGEN-INDUZIERTEN AKUTEN LEUKAEMIEN UND
NEOPLASIEN 135
5.2 IDENTIFIKATION VON HEDGEHOG-SIGNALWEG AKTIVIERENDEN ONKOGENEN IN
VIVO 145
5.3 EINFLUSS DER HEDGEHOG-SIGNALWEG-INHIBITION IN DER MURINEN MOZ-TIF2
POSITIVEN AKUTEN MYELOMONOZYTAEREN LEUKAEMIE 149
5.4 DIE MURINE JAK2V617F POSITIVE MYELOPROLIFERATIVE NEOPLASIE 150
5.4.1 EINFLUSS DER HEDGEHOG-SIGNALWEG-INHIBITION 150
5.4.2 ADDITIVE CHEMOTHERAPEUTIKA 152
5.4.2.1 INTERFERON OT IN DER MURINEN JAK2V617F POSITIVEN
MYELOPROLIFERATIVEN NEOPLASIE 152
5.4.2.2 CYTARABIN IN DER MURINEN JAK2V617F POSITIVEN MYELOPROLIFERATIVEN
NEOPLASIE 154
6 ZUSAMMENFASSUNG 155
7 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 156
8 TABELLENVERZEICHNIS 158
9 LITERATURVERZEICHNIS 159
10 PUBLIKATIONSVERZEICHNIS 174
11 DANKSAGUNG 175
12 EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG 176
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