Strukturell-funktionelle Charakterisierung der Zelloberfläche von Paramecium tetraurelia:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1999
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| Beschreibung: | III, 126 Bl. Ill., graph. Darst. 30 cm |
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INHALTSVERZEICHNIS
I
1 EINLEITUNG 1
1.1 PARAMECIUM 1
1.2 AUFBAU DES ZELLCORTEX 2
1.3 TRICHOCYSTEN UND IHRE VERANKERUNG AN DER ZELLMEMBRAN 5
1.4 OBERFLAECHENANTIGENE 6
1.5 ZIELSETZUNG DER UNTERSUCHUNG 10
2 MATERIAL UND METHODEN 11
2.1 VERWENDETE MATERIALIEN 11
2.2 ZELLKULTUREN 15
2.3 ANKONZENTRIEREN DER ZELLEN 15
2.4 BESTIMMUNG DER ZELLZAHLEN 16
2.5 VOLLSTAENDIGE EXOCYTOSE MIT AMINOETHYLDEXTRAN ALS SEKRETAGOG 17
2.6 VERSCHIEDENE METHODEN DER ZELLFRAKTIONIERUNG 17
2.6.1 DECILIIEREN DER ZELLEN 18
2.6.2 DIFFERENTIELLE EXTRAKTION VON MEMBRANPROTEINEN 19
2.6.3 ISOLIERUNG VON MEMBRANVESIKELN DER SOMATISCHEN ZELLMEMBRAN
20
2.6.4 ISOLIERUNG VON"SURFACE-ANTIGENS" AUS PARAMECIUM TETRAURELIA 21
2.7 PROTEINBESTIMMUNG ' 22
2.8 SDS-PAGE UND WESTEMBLOT 22
2.8.1 HERSTELLUNG VON SDS-GELEN 23
2.8.2 MARKERPROTEINE
25
2.8.3 PROBENBEHANDLUNG UND ELEKTROPHORESEBEDINGUNGEN
26
2.8.4 SILBERFAERBUNG VON POLYACRYLAMIDGELEN
27
2.8.3 TROCKNUNG UND KONSERVIERUNG VON POLYACRYLAMIDGELEN
28
2.8.6 ELEKTROTRANSFER VON PROTEINEN AUF NITROCELLULOSEMEMBRANEN 28
2.8.7 REVERSIBLE FAERBUNG MIT PONCEAU-S 30
2.8.8 IRREVERSIBLE FAERBUNG MIT AMIDOSCHWARZ 30
2.8.9 IMMUNDETEKTION AM WESTERN BLOT 31
2.8.10 MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG 32
2.9 HERSTELLUNG VON ANTISEREN GEGEN "SURFACE-ANTIGENS" VON
PARAMECIUM
TETRAURELIA 32
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
II
2.9.1 IMMUNISIERUNG VON
KANINCHEN 32
2.9.2 BESTIMMUNG DER ANTIKOERPERTITER GEGEN "SURFACE-ANTIGENS" IM
KANINCHENCHENBLUT 33
2.10 IMMOBILISIERUNGSTESTS
35
2.11
PERMEABILISIERUNG UND FLUORESZENZMARKIERUNG VON PARAMECIEN 36
2.12
SCHNELLEINFRIEREN UND GEFRIERBRUCH VON PARAMECIEN
37
2.13 "SDS-DIGESTED FREEZE FRACTURE REPLICA LABELING" (SDS-FRL) 38
2.14 TIEFTEMPERATUREINBETTUNG IN UNICRYL
39
2.15 PRAEEMBEDDING MARKIERUNGEN VON BIOTINYLIERTEN ZELLEN 40
2.16 HERSTELLUNG VON KOLLOIDALEM GOLD
41
2.17 KONJUGATION VON KOLLOIDALEM GOLD MIT PROTEIN-A/STEPTAVIDIN 42
2.18 SCHNITTMARKIERUNG AN ULTRADUENNSCHNITTEN MIT PROTEIN-A/GOLD
44
2.19 OBERFLAECHENBIOTINYLIERUNG VON LEBENDEN ZELLEN MIT BIOTIN
45
ADIOAKTIVE MARKIERUNG DER ZELLEN MIT [
L25I]
46
2.20.1 IN VIVO RADIOJODIERUNG VON OBERFLAECHENPROTEINEN MIT IODOGEN UND
ANSCHLIESSENDER
QUERVERNETZUNG MIT CROSSLINKEM UNTERSCHIEDLICHER REICHWEITE 46
2.20.2 SYNTHESE VON 5-[
L
25
I]IODONAPHTYL-L-AZID (INA) AUS 5-AMINONAPHTYL-L-AZID 48
2.20.3 IN VIVO RADIOJODIERUNG VON INTEGRALEN MEMBRANPROTEINEN DER
ZELLMEMBRAN MIT INA
UND DIE CHEMISCHE VERNETZUNG MIT HSAB 50
2.20.4 AUTORADIOGRAMME
5
\
3 ERGEBNISSE
51
3.1 ANALYSE DER BIOSYNTHESE- UND ABBAUWEGE VON KOMPONENTEN DER
SOMATISCHEN
ZELLOBERFLAECHE MITTELS IMMUNMARKIERUNGEN
52
3.1.1 ANTIKOERPERTITER GEGEN NICHTREDUZIERTES/REDUZIERTES
"SURFACE-ANTIGEN" IN DEN
SEREN IMMUNISIERTER KANINCHEN 52
3.1.2 IMMUNDETEKTION VON "SURFACE-ANTIGENS" AM WESTERN BLOT 53
3.1.3 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DER ANTISEREN
54
3.1.4 ANALYSE VON FLUORESZENZMARKIERTEN 7S ZELLEN IM CLSM 56
3.1.5 IMMUNOGOLDMARKIERUNGEN VON "SURFACE-ANTIGENS" AUF
ULTRUDUENNSCHNITTEN VON
PLT-UNICRYL EINGEBETTETEN ZELLEN
59
3.1.6
IMMUNOGOLDMARKIERUNGEN AM GEFRIERBRUCHREPLIKA
65
3.1.7 PRAEEMBEDDING MARKIERUNGEN VON OBERFLAECHENPROTEINEN 70
INHALTSVERZEICHNIS
III
3.2 DIFFERENTIELLE MARKIERUNG UND ISOLIERUNG VON PROTEINEN DER
SOMATISCHEN
ZELLOBERFLAECHE 73
3.2.1 ISOLIERUNG VON "SURFACE-ANTIGENS" AUS 7S-WILDTYPZELLEN DURCH
RTUMNLISRH
EXTRAKTION
73
3.2.2 SIND DIE EXTRAHIERTEN "SURFACE-ANTIGENS" MIT EINER PROTEASE
KONTAMINIERT? 74
3.2.2 WELCHE PROTEINE AUF DER ZELLOBERFLACHE SIND DURCH DIE RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
MIT DEM HYDROPHILEN MARKER [
1
Z
5
I]NA/IODOGEN ERREICHBAR?
77
3.2.4
WELCHE PROTEINE IN DER ZELLMEMBRAN SIND DURCH DIE
RADIOAKTIV
MARKIERUNG MIT
DEM LIPOPHILEN MARKER [
125
I]-INA ERREICHBAR? ' 78
3.2.5 LASST SICH DURCH DIE VERNETZUNG VON OBERFLACHENPROTEINEN DIE
FRAGMENTIERUNG
DER " SURFACE-ANTIGENS" VERHINDERN? 82
3.2.6 WIE VERAENDERT SICH DAS BANDENMUSTER BEI DEM VERGLEICH VON
MEMBRANPROTEINEN
AUS
UNGETRIGGERTEN
ZU
GETRIGGERTEN ZELLEN?
84
4 DISKUSSION 86
4.1 ANALYSE VON BIOSYNTHESE- UND ABBAUWEGEN DER "SURFACE-ANTIGENS" 86
4.1.1 BIOSYNTHESE UND EXOCYTOSE VON NEU SYNTHETISIERTEM
"SURFACE-ANTIGEN"
86
4.1.2 ENDOCYTOSE UND ABBAUWEGE VON VERBRAUCHTEM "SURFACE-ANTIGEN"
89
4.1.2.1 DER ABBAUWEG OBER DIE PARASOMALEN SBCKE 89
4.1.2.2 DER ABB
8
UWEG OBER DIE NAHRUNGSVAKUOLEN 9 ]
4.1.3 SCHLUSSFOLGERUNGEN 92
4.2 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER OBERFLAECHENPROTEINE 94
4.2.1 ISOLIERTE "SURFACE-ANTIGENS"
94
4.2.2 PROTEOLYTISCHE EFFEKTE IN ISOLIERTEN "SURFIICE-ANTIGENS" 95
4.2.3 RADIOJODIERUNG DER ZELLOBERFLACHE MIT [
125
I]NAI/IODOGEN 98
4.2.4 RADIOJODIERUNG VON PROTEINEN DER ZELLMEMBRAN MIT [
125
I]-INA 99
4.2.4.1 MOEGLICHE MOLEKULARE AEQUIVALENTE 99
4.2.5 QUERVEMETZUNGSEXPERIMENTE ] 03
4.2.5.1 CHAPS-EXTRAHIERTE MEMBRANPROTEINE AUS EXOCYTOSE-STIMULIERTEN
ZELLEN
103
4.2.5.2 QUERVEMETZUNGSEXPERIMENTE MIT CROSSLINKEM UNTERSCHIEDLICHER
SPANNWEITE
102
5 ZUSAMMENFASSUNG 105
6 VERZEICHNIS DER ABKUERZUNGEN 107
7
LITERATUR
109 |
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