LMP1-induzierte Teilungsaktivität in Zellen der Zelllinie CCL-25: ein Schritt zur Entstehung der Epstein-Barr-Virus-assoziierten Nasopharynxkarzinoms
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2006
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis 1
1 Einleitung 1
1.1 Das Epstein-Barr-Virus 1
1.2 Organisation des EBV und Funkzion ausgewählter Gene 1
1.3 Der Infektionsmechanismus des EBV 3
1.4 Die Bedeutung von LMP1 als potentielles Onkogen 5
1.5 Problemstellung 5
2 Material 7
2.1 Chemikalien 7
2.2 Plasmide 7
2.3 Primer 7
2.4 Restriktionsendonukleasen 8
2.5 Organismen 8
2.5.1 Bakterien 8
2.5.2 Eukaryonte Zellen 8
3 Methoden 9
3.1 Zellkulturtechniken 9
3.1.1 Kultivierung von Bakterien 9
3.1.1.1 Kultivierung von E.coli 9
3.1.1.2 Anreicherung von Bakterienzellen 10
3.1.2 Kultivierung von Mammalia-Zellinien 10
3.1.2.1 Anzucht der Zelllinie B95-8 und CCL-25 10
3.1.2.2 Einfrieren von Mammalia-Zellen 11
3.1.2.3 Auftauen von Mammalia-Zellen 11
3.1.2.4 Subkultivieren adhärent wachsender Zellkulturen 11
3.1.2.5 Quantifizierung von Mammalia-Zellen 12
3.2. Methoden rekombinanter DNA-Technologie 12
3.2.1 Plasmid-Minipräparation aus E.coli 12
3.2.1.1 Plasmidisolierung nach boiling prep-Methode (HOLMES und QUIGLY, 1981) 13
3.2.1.2 Minipräparation mit dem High Pure Plasnüd Isolation Kit (Boehringer Mannheim) 13
3.2.1.3 Plasmid-Maxipräparation aus E.coli 14
3.2.3 Plasmid-Präparation mit dem QIAGEN Plasmid Purification Kit (Q1AGEN, Hilden) 15
3.2.4 Isolierung viraler DNA aus Mammalia-Zellinien 15
3.2.5 Trennung von Nukleinsäuren mittels Elektrophorese 15
3.2.6 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 17
3.2.7 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 17
3.2.8 Phenol/Chloroform/Isomyalkohol-Extraktion (PCI-Extraktion) 18
Inhaltsverzeichnis II
3.2.9 Fällung von DNA aus wässrigen Lösungen 18
3.2.10 Ligieren 18
3.2.11 Restriktion von DNA 19
3.2.12 Methoden der Transformation 19
3.2.12.1 Transformation von E. coli 19
3.2.12.2 Elektro-Transfektion von CCL-25-Zellen 20
3.2.13 Isolierung von RNA 21
3.2.13.1 Isolierung vonTotal-RNA 21
3.2.13.2 Isolierung von poly (A) mRNA aus Total-RNA 21
3.2.14 cDNA Synthese 22
3.2.15 Polymerase Kettenreaktion (PCR) 23
3.2.16 Reverse Northern Blot Analyse 24
3.2.16.1 Herstellung DIG-markierter cDNA aus Total-RNA 24
3.2.16.2 Herstellung DIG-markierter cDNA aus mRNA 25
3.2.17 Dot-Blot 26
3.3 Immunologische Methoden 26
3.3.1 Immunologische Detektion der DIG-markierten cDNA 26
3.3.2 Prähybridisierung und Hybridisierung von Nylon-Membranen 26
3.3.3 Immunologische Detektion von Digoxygenin-markierten DNA-Sonden 27
3.3.4 Entfernung von Sonden nach Hybridisierung 28
3.3.5 Bestimmung der DNA-Syntheserate 29
3.3.6 Direkter Immunofluoreszenz Test 29
4 Ergebnisse 31
4.1 Konstruktion eines Expressionsvektors für das LMP1 Gen 31
4.1.1 Konstruktion von TA-LMP 31
4.1.2 Konstruktion von pCEP-LMP 35
4.2 Nachweis des erfolgreichen Transfers von pCEP-LMP in Zellen der Zellinie CCL-25 40
4.2.1 Elektroporation der CCL-25-Zellen 40
4.4.2 Tranfektion von Zellen der Zellinie CCL-25 mit pCEP4-LMP und pCEP 41
4.3 Nachweis über die erfolgreiche Expression von LMP1 in pCEP-LMP transfizierten
CCL-25-Zellen 42
4.3.1 Nachweis der Transkriptionvon LMP1 42
4.3.2 Nachweis der Translation von LMP1 43
4.4 Überexpression von LMP1 in CCL-25-Zellen 44
4.4.1 Analyse der DNA-Syntheserate und der Zellproliferation in pCEP-LMP transfizierten
CCL-25-Zellen 44
4.4.2 Reverse Northern Blot Analyse von pCEP-LMP und pCEP4 transfizierten CCL-25-Zellen 46
4.4.2.1 Herstellung von Hybridisierungssonden 46
4.4.2.2 Durchführung und Analyse des reversen Northern Blots 47
Inhaltsverzeichnis III
5 Diskussion 50
5.1 Konstruktion eines geeigneten Expressionsvektors für LMP1 50
5.2 Transfer des Expressionsvektors in Epithelzellen 52
5.3 Überexpression von LMP 54
5.4 Ausblick 58
6 Zusammenfassung 59
7 Literaturliste 60
|
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Inhaltsverzeichnis 1
1 Einleitung 1
1.1 Das Epstein-Barr-Virus 1
1.2 Organisation des EBV und Funkzion ausgewählter Gene 1
1.3 Der Infektionsmechanismus des EBV 3
1.4 Die Bedeutung von LMP1 als potentielles Onkogen 5
1.5 Problemstellung 5
2 Material 7
2.1 Chemikalien 7
2.2 Plasmide 7
2.3 Primer 7
2.4 Restriktionsendonukleasen 8
2.5 Organismen 8
2.5.1 Bakterien 8
2.5.2 Eukaryonte Zellen 8
3 Methoden 9
3.1 Zellkulturtechniken 9
3.1.1 Kultivierung von Bakterien 9
3.1.1.1 Kultivierung von E.coli 9
3.1.1.2 Anreicherung von Bakterienzellen 10
3.1.2 Kultivierung von Mammalia-Zellinien 10
3.1.2.1 Anzucht der Zelllinie B95-8 und CCL-25 10
3.1.2.2 Einfrieren von Mammalia-Zellen 11
3.1.2.3 Auftauen von Mammalia-Zellen 11
3.1.2.4 Subkultivieren adhärent wachsender Zellkulturen 11
3.1.2.5 Quantifizierung von Mammalia-Zellen 12
3.2. Methoden rekombinanter DNA-Technologie 12
3.2.1 Plasmid-Minipräparation aus E.coli 12
3.2.1.1 Plasmidisolierung nach "boiling prep-Methode (HOLMES und QUIGLY, 1981) 13
3.2.1.2 Minipräparation mit dem High Pure Plasnüd Isolation' Kit (Boehringer Mannheim) 13
3.2.1.3 Plasmid-Maxipräparation aus E.coli 14
3.2.3 Plasmid-Präparation mit dem "QIAGEN Plasmid Purification Kit' (Q1AGEN, Hilden) 15
3.2.4 Isolierung viraler DNA aus Mammalia-Zellinien 15
3.2.5 Trennung von Nukleinsäuren mittels Elektrophorese 15
3.2.6 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 17
3.2.7 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 17
3.2.8 Phenol/Chloroform/Isomyalkohol-Extraktion (PCI-Extraktion) 18
Inhaltsverzeichnis II
3.2.9 Fällung von DNA aus wässrigen Lösungen 18
3.2.10 Ligieren 18
3.2.11 Restriktion von DNA 19
3.2.12 Methoden der Transformation 19
3.2.12.1 Transformation von E. coli 19
3.2.12.2 Elektro-Transfektion von CCL-25-Zellen 20
3.2.13 Isolierung von RNA 21
3.2.13.1 Isolierung vonTotal-RNA 21
3.2.13.2 Isolierung von poly (A) mRNA aus Total-RNA 21
3.2.14 cDNA Synthese 22
3.2.15 Polymerase Kettenreaktion (PCR) 23
3.2.16 Reverse Northern Blot Analyse 24
3.2.16.1 Herstellung DIG-markierter cDNA aus Total-RNA 24
3.2.16.2 Herstellung DIG-markierter cDNA aus mRNA 25
3.2.17 Dot-Blot 26
3.3 Immunologische Methoden 26
3.3.1 Immunologische Detektion der DIG-markierten cDNA 26
3.3.2 Prähybridisierung und Hybridisierung von Nylon-Membranen 26
3.3.3 Immunologische Detektion von Digoxygenin-markierten DNA-Sonden 27
3.3.4 Entfernung von Sonden nach Hybridisierung 28
3.3.5 Bestimmung der DNA-Syntheserate 29
3.3.6 Direkter Immunofluoreszenz Test 29
4 Ergebnisse 31
4.1 Konstruktion eines Expressionsvektors für das LMP1 Gen 31
4.1.1 Konstruktion von TA-LMP 31
4.1.2 Konstruktion von pCEP-LMP 35
4.2 Nachweis des erfolgreichen Transfers von pCEP-LMP in Zellen der Zellinie CCL-25 40
4.2.1 Elektroporation der CCL-25-Zellen 40
4.4.2 Tranfektion von Zellen der Zellinie CCL-25 mit pCEP4-LMP und pCEP 41
4.3 Nachweis über die erfolgreiche Expression von LMP1 in pCEP-LMP transfizierten
CCL-25-Zellen 42
4.3.1 Nachweis der Transkriptionvon LMP1 42
4.3.2 Nachweis der Translation von LMP1 43
4.4 Überexpression von LMP1 in CCL-25-Zellen 44
4.4.1 Analyse der DNA-Syntheserate und der Zellproliferation in pCEP-LMP transfizierten
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4.4.2 Reverse Northern Blot Analyse von pCEP-LMP und pCEP4 transfizierten CCL-25-Zellen 46
4.4.2.1 Herstellung von Hybridisierungssonden 46
4.4.2.2 Durchführung und Analyse des reversen Northern Blots 47
Inhaltsverzeichnis III
5 Diskussion 50
5.1 Konstruktion eines geeigneten Expressionsvektors für LMP1 50
5.2 Transfer des Expressionsvektors in Epithelzellen 52
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5.4 Ausblick 58
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