Systematische Analyse der Interaktionen von Proteinen des Yersinia enterocolitica pYV Virulenzplasmids:
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS:
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS V
ZUSAMMENFASSUNG 1
1 EINLEITUNG 3
1.1 DIE GATTUNG YERSINIA 3
1.1.1 YERSINIA PESTIS 3
1.1.2 YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS UND YERSINIA ENTEROCOLITICA 4
1.1.3 YERSINIA ENTEROCOLITICA 4
1.1.3.1 VORKOMMEN UND VERBREITUNG 5
1.1.3.2 DAS VIRULENZ PLASMID VON Y. ENTEROCOLITICA 5
1.1.3.3 DAS PROTEOM VON Y. ENTEROCOLITICA 6
1.1.3.4 DIE PATHOGENITAETSFAKTOREN VON Y. ENTEROCOLITICA 9
1.1.3.4.1 YAD A UND INV FUER ADHAERENZ UND INVASION 9
1.1.3.4.2 DAS TYP ILL-SEKRETIONSSYSTEM VON Y. ENTEROCOLITICA 10
1.1.3.4.3 DIE YERSINIA EFFEKTORPROTEINE (YOPS) 11
1.2 DIE ZELLULAERE IMMUNABWEHR NACH KONTAKT MIT Y. ENTEROCOLITICA 14
1.2.1 INTERFERONE, 14
1.2.2 DIE ROLLE VON TBK1 IN PRODUKTION VON TYP I INTERFERONE 15
1.2.3 SIGNALTRANSDUKTION DURCH TYP I INTERFERONE 16
1.2.4 NF- K B 17
1.2.5 DIE ROLLE VON TBK1 IN NF-KB AKTIVIERUNG 19
1.3 SYSTEMBIOLOGIE 20
1,3. 1 NETZWERKTOPOLOGIE 20
1.3.2 ZUFALLS- UND SCALE FREE- NETZWERKE 21
1.3.3 DIE ERSTELLUNG PROTEIN-INTERAKTIONSNETZWERKEN MITTELS
HEFE-ZWEI-HYBRID SYSTEM 23 1.3.4 ZELLULAERE NETZWERKE 23
2 MATERIAL UND METHODEN 25
2.1 MATERIAL 25
2.1.1 LABORGERAETE 25
2.1.2 SOFTWARE 26
2.1.3 CHEMIKALIEN 26
2.1.4 VERBRAUCHSMATERIAL 28
2.1.5 MOLEKULARGEWICHT-STANDARDS ; 29
2.1.6 KITS 29
2.1.7 ENZYME 29
2.1.8 OLIGONUKLEOTIDE 30
2.1.9 PLASMIDE 38
2.1.10 ORGANISMEN UND SAEUGERZELLEN 45
2.1.10.1 E. COLI STAEMME 45
2.1.10.2 YERSINIASTAEMME 46
2.1.10.3 HEFESTAEMME 46
2.1.10.4 SAEUGERZELLLINIEN 47
2.2 METHODEN 47
2.2.1 NAEHRMEDIEN UND KULTIVIERUNG 47
2.2.2 KULTIVIERUNG VON BAKTERIEN 47
2.2.3 KULTIVIERUNG VON YERSINIEN 48
2.2.4 ANLEGEN EINER STAMMSAMMLUNG 48
2.2.5 NAEHRMEDIEN ZUR KULTIVIERUNG VON HEFE S. CEREVISIAE 48
2.2.6 ZELLKULTUR 50
2.2.6.1 NAEHRMEDIEN, KULTIVIERUNG UND KRYO-KONSERVIERUNG VON
EUKARYOTISCHEN ZELLEN 50 2.2.7 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 50
VIII
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.7.1 HERSTELLUNG CHEMISCH KOMPETENTER BAKTERIEN 50
2.2.7.2 TRANSFORMATION VON CHEMISCH KOMPETENTEN ZELLEN 51
2.2.7.3 ELEKTROTRANSFORMATION VON E. COLI- ZELLEN 51
2.2.7.3.1 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER E. COLI- ZELLEN 51
2.2.7.3.2 TRANSFORMATION VON ELEKTROKOMPETENTEN ZELLEN 52
2.2.7.4 HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER YERSINIEN 52
2.2.7.4.1 ELEKTROPORATION 53
2.2.7.5 BESTIMMUNG DER OPTISCHEN DICHTE VON BAKTERIENSUSPENSIONEN 53
2.2.7.6 EINSTELLUNG DER MOI 53
2.2.7.7 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL VON SAEUGERZELLEN 53
2.2.7.8 TRANSFEKTION VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN 53
2.2.7.9 AUFTRENNUNG VON PROTEINEN MITTELS
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 54 2.2.7.10 PROTEINTRANSFER AUF DIE
NITROCELLULOSE-MEMBRAN: WESTERN BLOT ANALYSE 54 2.2.7.11 DETEKTION
SPEZIFISCHER PROTEINE MITTELS IMMUNOBLOTTING 54
2.2.7.12 MODIFIZIERTER LUMIER BINDUNGSASSAY 56
2.2.8 DNA- UND RNA-TECHNIKEN 57
2.2.8.1 ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 57
2.2.8.1.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 57
2.2.8.1.2 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS EUKARYOTISCHEN ZELLEN 57
2.2.8.2 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 57
2.2.8.3 DNA-SPALTUNG MIT RESTRIKTIONSENZYMEN 57
2.2.8.4 LIGATION 58
2.2.8.55 - DEPHOSPHORVLIERUNASREAKTION 58
2.2.8.6 TA-KLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN 58
2.2.8.7 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 58
2.2.8.8 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 59
2.2.8.9 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 59
2.2.8.9.1 NESTED POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR) FUER DIE AMPLIFIKATION
VON DNA ZUR *REKOMBINATIONSKLONIERUNG 59
2.2.8.10 REKOMBINATIONSKLONIERUNG 60
2.2.8.11 ZIELGERICHTETE MUTAGENESE 61
2.2.8.12 SEQUENZIERUNG VON DNA 61
2.2.8.13 REALTIME PCR-QUANTIFIZIERUNG VON RNA-TRANSKRIPTEN MITTELS
TAQMAN*-PCR 61 2.2.9 MIKROSKOPISCHE METHODEN 62
2.2.9.1 IMMUNFLUORESZENZ- UND DAPI-FAERBUNG IN SAEUGERZELLEN 62
2.2.10 HEFE-2-HYBRID-METHODEN 63
2.2.10.1 DAS HEFE-ZWEI-HYBRID-SYSTEM 63
2.2.10.2 HERSTELLUNG VON KOMPETENTEN HEFEN 64
2.2.10.3 TRANSFORMATION VON HEFEZELLEN 64
2.2.10.4 DIE DURCHFUEHRUNG DES Y2H-SCREENS ZWISCHEN YERSINIA-PROTEINEN 65
2.2.10.5 DIE DURCHFUEHRUNG DES Y2H-SCREENS GEGEN CDNA GENBANKEN 66
2.2.10.5.1 ALLGEMEINE UEBERSICHT 66
2.2.10.5.2 MATING VON HEFEN_ 67
2.2.10.5.3 SCREENINGTIEFE 68
2.2.10.5.4 VORSCREEN (PRESCREEN) 68
2.2.10.5.5 AUTOAKTIVIERUNG 68
2.2.10.5.6 BIOMEKFX 68
2.2.10.5.7 KOLONIE-PCR 69
2.2.10.5.8 FRAGMENTANALYSE 70
2.2.10.5.9 SEQUENZIERUNG 71
2.2.10.5.10 FALSCH-POSITIVE INTERAKTIONEN 71
2.2.11 DUAL-LUZIFERASE ASSAY 71
2.2.11.1 DUAL-LUZIFERASE ASSAY MIT YERSINIA-MUTANTEN 71
2.2.12 ISOLIERUNG VON SEZERNIERTEN PROTEINEN ( RELEASED PROTEINS) 72
3 ERGEBNISSE 73
3.1 HERSTELLUNG EINER Y. ENTEROCOLITICA ENTRYVEKTOR KLONKOLLEKTION 74
3.2 IDENTIFIKATION VON INTRABAKTERIELLEN PPI 74
IX
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
3.3 ERSTELLUNG EINES INTERAKTIONSNETZWERKS ZWISCHEN PYV PLASMID
PROTEINEN VON Y. ENTEROCOLITICA 77
3.4 IDENTIFIKATION UND CHARAKTERISIERUNG VON PPI ZWISCHEN YERSINIA PYV
UND WIRTSPROTEINEN 78
3.5 VALIDIERUNG VON PATHOGEN-WIRT INTERAKTIONEN MITTELS LUMIER
BINDUNGSASSAYS _83
3.6 DAS YERSINIA EFFEKTORPROTEIN YOPM INTERAGIERT MIT PKN1 UND
ZINKFINGERPROTEINEN 85
3.7 DIE C-TERMINALEN 32 AMINOSAEUREN VON YOPM SIND FUER DIE INTERAKTION
MIT PKN1 VERANTWORTLICH 87
3.8 DAS YERSINIA EFFEKTORPROTEIN YOPO FUEHRT ZUR AKTIVIERUNG DES IFN-SS
PROMOTORS 88
3.9 DAS YERSINIA EFFEKTORPROTEIN YOPO STIMULIERT DEN NF-KB SIGNALWEG 92
3.10 YOPO INDUZIERT IFN-SS- UND NF-KB-SIGNALWEGE 94
3.11 DIE INFEKTION VON J774 ZELLEN MIT WILDTYP-YERSINIEN UND DER YOPO
MONOSEKRETIONSMUTANTE VERSTAERKT DIE INTERFERON-SS-EXPRESSION 96
3.12 NACHWEIS DER SEKRETION VON Y. ENTEROCOLITICA ORF155, YSCO, ORF73,
YSCY 97
4 DISKUSSION 99
4.1 VORTEILE DES Y2H SYSTEMS 99
4.1.1 VERGLEICH DER ERGEBNISSE DES Y2H-SCREENS MIT ANDEREN METHODEN ZUR
IDENTIFIKATION VON PPI 100
4.2 EINSCHRAENKUNGEN UND NACHTEILE DES Y2H SYSTEMS 100
4.2.1 METHODEN UND DIE STATISTISCHE KRITERIEN ZUM UNTERBINDEN VON
FALSCH-NEGATIVEN UND FALSCH POSITIVEN INTERAKTIONEN 101
4.3 STRUKTUR VON INTRAPATHOGENEN- UND PATHOGEN-WIRT
INTERAKTIONSNETZWERKEN102 4.3.1 ERKENNTNISSE AUS DER INTERPRETATION VON
YERSINIA-INTERAKTIONS-DATEN 105
4.4 AUF DER SUCHE NACH DER FUNKTION VON YOPM 106
4.5 DIE ROLLE VON YOPO BEI DER INDUKTION VON TYP 1 INTERFERONEN UND
NF-KB SIGNALWEG 108
4.6 AUF DER SUCHE NACH WEITEREN EFFEKTORPROTEINEN VON Y.
ENTEROCOLITICA 111
4.7 PERSPEKTIVEN 111
5 ANHANG 114
DANKSAGUNGEN 137
LEBENSLAUF 138
X
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