Immunhistochemische und funktionelle Charakterisierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase p38 in der inneren Uhr von Drosophila melanogaster: = Immunhistochemical and functional characterisation of the mitogen-activated protein kinase p38 in the endogenous clock of Drosophila melanogaster
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Würzburg
2015
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| adam_text | .MMUNHISTOCHEMISCHE UND FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG
DER MITOGEN-AKTIVIERTEN PROTEINKINASE
***
IN DER
INNEREN UHR VON DROSOPHILA MELANOGASTER
DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DES NATURWISSENSCHAFTLICHEN DOKTORGRADES
D O C T O R R E R U M N A T U R A L I U M
(DR. RER. NAT.)
DER JULIUS-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET WURZBURG
VORGELEGT VON
VERENA DUSIK
FRANKFURT AM MAIN
WUERZBURG 2015
I
NHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS...................................................................................................V
TABELLENVERZEICHNIS......................................................................................................V
I
ABBKURZUNGSVERZEICHNIS............................................................................................
VIN
1
EINLEITUNG....................................................................................................................
1
1 *1 MITOGEN-AKTIVIERTE PROTEINKINASEN (****)
.........................................................
1
1.1.1 MAPKS UND HRE BEDEUTUNG FUER DEN
ORGANISMUS.....................................1
1 _1 *2 **** SIGNALWEGE
*
WEGE INTRAZELLULAERER KOMMUNIKATION......................2
1.1.3 **** *38 IN DROSOPHILA
MELANOGASTER....................................................4
1.2 DIE INNERE UHR VON DROSOPHILA
MELANOGASTER......................................................6
1.2.1 NEURONALE
ORGANISATION....................................................
**********6
1.2.2 MOLEKULARER
MECHANISMUS........................................................................
8
1.23 PROTEINPHOSPHORYLIERUNG ALS REGULATIONSMECHANISMUS M
MOLEKULAREN
UHRWERK...............................................................................IO
1.3 STRESS, INNERE UHR UND MAP-KINASEN
................................................................
13
1.4 ZIELSETZUNG DIESER
ARBEIT....................................................................................15
2
MATERIAL.......................................................................................................................17
2.1
FLIEGENSTAEMME...................................................................................................
17
2.2
BAKTERIENSTAEMME...............................................................................................
18
2.3
MEDIEN...............................................................................................................
19
2.4
VEKTOR..................................................................................................................19
2.5
OLIGONUKLEOTIDE..................................................................................................
20
2.6 ANTIKOERPER UND
SEREN.........................................................................................*
*
2.7
KITSYSTEME.........................................................................................................
23
2.8 PUFFER UND
LOESUNGEN..........................................................................................23
2.9 GROESSENSTANDARDS
*
ENZYME UND
PROTEINE........................................................... 25
2.10 CHEMIKALIEN UND
VERBRAUCHSMATERIALIEN...........................................................
26
3
METHODEN..................................................................................................................
27
3.1
VERHALTEN............................................................................................................
27
3.1 _1 ENTRAINMENT UND AUFZEICHNUNG DER
LAUFAKTIVITAET....................................27
3.1.2 AUSWERTUNG DER
AKTIVITAETSDATENDATEN.....................................................28
3.2 METHODEN AUF DNA-EBENE
................................................................................
30
3.2.1 DNA-EXTRAKTION UND
REINIGUNG...............................................................30
3.2.1.1 EXTRAKTION VON PLASMID-DNA (DNA-MINIPRAEPARATION) .._* _..
30
321.2 BESTIMMUNG VON KONZENTRATION UND REINHEIT. * *..
31
3.2.2 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR)
........................................................
31
3.23 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON
DNA.............................................. 33
3.2.4 AUFREINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN
..........................................................
34
3.2.5 RESTRIKTIONSVERDAU UND DEPHOSPHORYLIERUNG
..........................................
34
3.2.6
LIGATION...................................................................................................
35
3.2.7 HITZESCHOCKTRANSFORMATION VON E.COL
....................................................
35
3.2.8
DNA-SEQUENZIERUNG...............................................................................
36
3.3 METHODEN AUF
RNA-EBENE.................................................................................
36
3.31 ISOLIERUNG DER
GESAMT-RNA....................................................................36
3.3.2 REVERSE TRANSKRIPTION DER MRNA
..........................................................
36
3.3.3 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR (QPCR)
........................................................
36
3.4 PROTEINBIOCHEMISCHE * *
.........................................................................38
3.4.1 EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE N E.COL
..........................................
38
3.4.1.1 KULTIVIERUNG UND INDUKTION DER PROTE*NEXP
*
ESS*ON. _. *
....
**
.._..
* _. 38
3.4.1.2 HERSTELLUNG VON BAKTERIEN^
.................................................
38
3.4.1.3 PROTEINAUFREINIGUNG MITTELS NI-CHELAT
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE........................................................
39
3.4.1.4 PUFFERAUSTAUSCH UND KONZENTRIERUNG GEREINIGTER PROTEINE
MITTEL
ULTRAFILTRATION....................................................................40
3.4.1.5 PROTEINMENGENBESTIMMUNG MITTELS
SPOTTEST........................... 40
3.4.2 PROTEINISOLIERUNG AUS ADULTEN FLIEGENKOEPFEN
..........................................
40
3.4.3 POLYACRYLAMID-GELELEKTRO^^ 41
3.4.3.1 NATRIUMDODECYLSULFAT-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHOREE
(SDSPAGE).............................................................................41
3 .4 3 2 HARNSTOFF-POLYACRYLAMIDGELELEKTROP^ (HARNSTOFF-PAGE) 42
3.4.4 PROTEINNACHWEIS MITTELS COOMASSIE-FAERBUNG
........................................
43
3.4.5
3.4.5.1 PROTEINTRANSFER MITTELS WET-BLOT
................................................
44
3.4.5.2 PROTEINTRANSFER MITTELS SEMI-DRY-BLOT
.......................................
44
3.4.5.3 IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS VON
PROTEINEN.............................. 45
3.4.6 IN VITRO
KINASENASSAYS............................................................................45
3.5 IMMUNHISTOCHEMISCHE METHODEN
46
35.1
IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG......................................................................46
3.5.1.1 FAERBUNG ADULTER
DROSOPHILA GEHIRNE
.........................................
46
3.5.1 *2 FAERBUNG ADULTER DROSOPHILA RETINAS
...................................
48
3.5.2 VISUALISIERUNG UND
3.6 STATISTISCHE AUSWERTUNG
4
ERGEBNISSE................................................................................................................50
4.1 LOKALISATION UND EXPRESSION VON P38 **** N GEHIRN UND RETINA VON
50
...................................................................................
.
DROSOPHILA MELANOGASTER
50**.*.***
4.1
*1
UNTERSUCHUNG DER P38 EXPRESSION MITTELS REPORTERLINIEN
56
...................................
KOERPERFAE*BUNG AN WILDTYPISCHEN FLIEGEN
*4.1.2
P38-ANT
64
....................................
4.1.3
ENDOGENE EXPRESSION VON
66
...............................................
*..4.2
AKTIVIERUNG VON P38 IM CIRCADIANEN SYSTEMS
70
.. . ..
4.3
*
NFLUSS DES P38 EXPRESSIONSLEVEIS AUF DAS RHYTHMISCHE LAUFVERHALTEN
4.3.1
AKTIVITAETSRHYTHMIK VON FLIEGEN MIT HERUNTERREGULIERTEM P38B
70
................................................................................................
SIGNALWEG
77**
4.3.2
AKTIVITAETSRHYTHMIK VON FLIEGEN MIT UEBEREXPRIMIERTEN P38B SIGNALWEG
4.3.3
AKTIVITAETSRHYTHMIK VON FLIEGEN MIT HERUNTERREGULIERTEM P38A
79
................................................................................................
SIGNALWEG
81*
4.3.4
AKTIVITAETSRHYTHMIK VON P38A*I UND P38T * 45 SINGLE-KNOCKOUTMUTANTEN
83***
4.3.5
AKTIVITAETSRHYTHMIK VON P38T * 45] *38*^1 DOPPEL-KNOCKOUTMUTANTEN
87
**********
.4.4
FUNKTION UND BEDEUTUNG VON P38 FUER DEN MOLEKULAREN MECHANISMUS
4.4.1
NUKLEAERE TRANSLOKATION DER UHRPROTEINE PER UND TIM IN FLIEGEN MIT
87
............................................................
MANIPULIERTEN
P38B SPIEGEL
4.4.2
AUSWIRKUNGEN REDUZIERTER P38B SPIEGEL AUF DAS CIRCADIANE
92
.......................
PHOSPHORYLIERUNGSMUSTER
VON PER
4.4.3
NICHTRADIOAKTIVE IN VITRO KINASEN ASSAYS ZUR IDENTIFIZIERUNG MOEGLICHER
94
....................................................
ERUNGSSTEIE^ N PER
*
P38-PHOSPHORYL
98
................................................................................................................
5
DISKUSSION
5.1
RETINALE EXPRESSION VON *** GIBT KEINE AUFSCHLUESSE UEBER EINE MOEGLICHE
ROLLE
98***
..................................................
M PERIPHEREN OSZILLATOR IM KOMPLEXAUGE
ON IN*5.2
ANTIKOERPERFAERBUNGEN UND REPORTERLINIEN OFFENBAREN P38-EXP*ESS
100
............................................................................
UHRNEURONEN VON DROSOPHILA
5.3 PHOSPHORYLIERUNG VON *38 M CIRCADIANEN SYSTEM UNTERLIEGT EINER
LICHT* UND
UHRGESTEUERTEN
REGULATION...............................................................................
103
5.4 MODIFIZIERTE *** SPIEGEL IN UHRNEURONEN FUEHREN ZU VERAENDERUNGEN N
DER
RHYTHMISCHEN LAUFAKTIVITAET
...............................................................................
105
5-5 FUNKTIONELLE REDUNDANZ ALS MOEGLICHER GRUND FEHLENDER
VERHALTENSPHAENOTYPEN IN P38A UND P38B SINGLE-KNOCKOUTMUTANTEN
............. 106
5.6 P38 PHOSPHORYLIERT PER UND STEUERT DESSEN WANDERUNG IN DEN
ZELLKERN**** 108
6
ANHANG....................................................................................................................
112
7
ZUSAMMENFASSUNG.................................................................................................120
* SUMMARY 122
.............. *****.***********.*.....**
........****
*******
.......***.*.*******.
9
LITERATURVERZEICHNIS............................................................................................*124
10
DANKSAGUNG............................................................................................................138
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| spelling | Dusik, Verena ca. 21. Jh Verfasser (DE-588)1098345983 aut Immunhistochemische und funktionelle Charakterisierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase p38 in der inneren Uhr von Drosophila melanogaster = Immunhistochemical and functional characterisation of the mitogen-activated protein kinase p38 in the endogenous clock of Drosophila melanogaster vorgelegt von Verena Dusik, Frankfurt am Main Immunhistochemical and functional characterisation of the mitogen-activated protein kinase p38 in the endogenous clock of Drosophila melanogaster Würzburg 2015 IX, 138 Seiten Illustrationen, Diagramme txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Dissertation Julius-Maximilians-Universität Würzburg 2015 Zusammenfassung in deutscher und englischer Sprache Taufliege (DE-588)4078168-9 gnd rswk-swf MAP-Kinase (DE-588)4576144-9 gnd rswk-swf Biologische Uhr (DE-588)4145622-1 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Taufliege (DE-588)4078168-9 s Biologische Uhr (DE-588)4145622-1 s MAP-Kinase (DE-588)4576144-9 s DE-604 Erscheint auch als Online-Ausgabe urn:nbn:de:bvb:20-opus-124636 https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-124636 Resolving-System kostenfrei Volltext DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=028946351&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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